Près de tomographie optique de projection infrarouge pour l'évaluation de la distribution de masse β-cellulaire en recherche sur le diabète
Summary
Nous décrivons l'adaptation de la tomographie optique de projection (OPT)<sup> 1</sup> À l'imagerie dans le proche infrarouge, et la mise en œuvre d'un certain nombre d'outils informatiques. Ces protocoles permettent l'évaluation des β du pancréas masse des cellules (BCM) chez les grands spécimens, d'augmenter la capacité de la technique multicanal et augmenter la qualité des données OPT.
Abstract
En adaptant OPT pour inclure la capacité de formation d'image dans le proche infrarouge (NIR) du spectre, on illustre ici la possibilité d'organes d'image agrandie de tissu pancréatique, tels que le pancréas de rat, et à augmenter le nombre de canaux (types cellulaires) qui peut être étudiée dans un échantillon unique. En outre, nous décrivons la mise en œuvre d'un certain nombre d'outils informatiques qui fournissent: positionnement 1 / précision (dans notre cas, le pancréas) un spécimen du centre de masse (COM) à l'axe de rotation (AR) 2; 2 algorithmes / améliorées pour poste -alignement de réglage qui empêche les distorsions géométriques lors de la reconstruction tomographique 2 et 3 / un protocole d'égalisation pour augmenter l'intensité de rapports signal sur bruit dans des déterminations fondées sur BCM OPT 3. En outre, nous décrivons un porte-échantillon qui minimise le risque pour les mouvements involontaires de l'échantillon lors de l'acquisition. Ensemble, ces protocoles permettent l'évaluation de la distribution BCM et OTHcaractéristiques euh, à effectuer tout le volume du pancréas intact ou d'autres organes (par exemple, dans les études sur la transplantation d'îlots), avec une résolution allant jusqu'au niveau des îlots de Langerhans. individuels
Introduction
Le productrices d'insuline des cellules β sont essentiels pour la capacité du corps à contrôler l'homéostasie du glucose sanguin. Par conséquent, l'évaluation de la distribution BCM pancréas sont indispensables pour de nombreux domaines de recherche sur le diabète pré-clinique. Dans les évaluations de régimes thérapeutiques, par exemple, l'impact de l'ablation génique ciblée sur la différenciation des cellules endocrines ou des études d'étiologie du diabète dans des modèles rongeurs de la maladie dépendent souvent de telles analyses. Traditionnellement, ce type d'évaluation se sont appuyés sur fastidieuses démarches stéréologiques qui sont difficiles à réaliser en raison de la taille et la complexité constitution anatomique du pancréas. La plupart des approches d'imagerie haute résolution à l'heure actuelle (en général, optique), ne fournissent pas de profondeur de pénétration suffisante pour permettre l'imagerie du pancréas entier chez les rongeurs. A l'inverse, des méthodes d'imagerie qui ne sont pas limités par leur profondeur de pénétration (typiquement nucléaire) fournir à faible résolution pour résoudre la distribution BCM plein et sont entravéspar le manque d'agents de contraste suffisants 4,5.
Tomographie optique de projection est une modalité d'imagerie 3D qui permet des évaluations à haute résolution d'échantillons biomédicaux sur la mm à l'échelle 6 cm. Par la présente, des informations sur la position dans l'espace et le volume de l'insuline individu exprimant des îlots de Langerhans peut être extrait à travers le volume du pancréas chez les souris normales et 3,7-10 diabétique. L'objectif de la présente étude consiste à renforcer la capacité de cette technique pour l'évaluation de la β-cellules pancréatiques; leur répartition endogène, lorsqu'ils sont greffés dans d'autres tissus, leur relation avec les constituants du pancréas (tels que l'infiltration types de cellules) et dans les grandes préparations pancréatiques qu'auparavant.
La proximité de la tomographie optique de projection infrarouge (NIR-OPT) de configuration
Dans le dessous de protocoles, d'un scanner basé sur la TPO en place d'original décrit par Sharpe <em> 1 et al, adapté pour l'imagerie dans l'infrarouge proche est décrit et utilisé. Pour l'évaluation de canal unique du pancréas de la souris (par exemple de BCM), le SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner peut être utilisé.
Lampe à halogénure métallique qui fournit de l'énergie d'excitation plus élevée qu'une lampe à arc au mercure à des longueurs d'onde 650 nm au-dessus, fournit la lumière d'excitation. La lumière est transmise à travers un guide de lumière liquide. Une combinaison de fluorochromes utiles et des filtres passe-bande pour NIR imagerie par fluorescence et la séparation des canaux est représenté sur la figure 3. La lumière émise est détectée avec une caméra CCD rétro-éclairé, avec un rendement quantique élevé dans le spectre proche infrarouge. Le balayage OPT est automatisé à l'aide d'une plate-forme LabVIEW qui contrôle la caméra et moteur pas à pas. Pour soutenir les échantillons de la taille de pancréas de rat intact, un miroir d'argent revêtu protégé et une cuvette large est utilisé. Enfin, un porte-échantillon qui élimine les indésirables movemen verticalests de l'échantillon pendant le balayage a été conçu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques décrites pour OPT imagerie permet l'extraction de paramètres spatiaux et quantitative dans tout le volume du pancréas murin. En raison de limitations dans la résolution possible pour ce type d'imagerie mésoscopique il convient de noter que, comme pour la plupart des modalités d'imagerie, plus l'échantillon inférieur le la résolution (Bien que l'utilisation d'une résolution plus élevée CCD devrait augmenter la résolution de la numérisation OPT) . Ainsi, pour l'évaluation de la souris intactes lobes du pancréas, de la technique à l'heure actuelle ne fournit pas la résolution cellule unique bien que proche (environ 15-20 um) 7. Pourtant, pour l'extraction de la distribution BCM dans le pancréas de souris les protocoles ont fourni des données qui correspondent à plus que bien ceux obtenus par exemple le point de comptage morphométrie 3,13 Il convient de noter que, bien que la mise en œuvre du protocole CLAHE permet la détection d'îlots significativement plus , ces îlots sont généralement plus petits et ne contrite essentiellement aux β-ensemble de cellules volumes.
Les protocoles immunohistochimiques impliqués sont relativement longues (jusqu'à deux semaines), mais les mains réelles sur le temps de préparation de l'échantillon est court et donc la technique est bien adaptée à l'étude de grandes cohortes d'animaux 9. Si le potentiel des modes de distribution hétérogènes est une priorité pour l'enquête, il convient de souligner que des précautions doivent être prises dans les étapes concernant la fixation et le montage pour éviter que le tissu pancréatique est fixé de manière défavorable et un plat ("étalée" ) de montage du tissu faudrait s'efforcer de faciliter de telles évaluations.
Une question importante lors de l'exécution OPT, c'est que COM de l'échantillon est fixé à l'axe de rotation et qu'il ne bouge pas, verticalement ou horizontalement, au cours de la procédure de numérisation. Par conséquent, il est essentiel d'avoir une configuration mécanique stable et un système qui fonctionne bien pour attaching de l'échantillon. Nous avons résolu ce problème en construisant une nouvelle monture (Figure 7).
Géométrie parallèle n'était pas le cas de notre NIR-OPT ou Bioptonics 3001 scanner, qui a été détecté comme un décalage vertical entre les positions arrière et avant des objets périphériques dans les images de projection enregistrées. En ajustant l'objet à distance de la source dans le fichier journal du scanner respectif (voir 2.3.1) nous avons pu améliorer considérablement la qualité de nos données et de corriger les distorsions géométriques sur les bords loin des images de projection, ce qui est particulièrement important lorsque évaluer les plus grands spécimens.
Dans le protocole actuel, nous fournissons une suggestion de jeux de filtres qui permettent de visualiser des trois différents canaux spécifiques et une «anatomie» de canaux dans les évaluations des préparations pancréatiques intacts. Bien entendu, ces paramètres peuvent être modulés pour mieux répondre aux fluorochromes utilisés pour une étude donnée même si, comme toutes les formes de fluorescencemicroscopie cent, le danger potentiel du signal transpercement doit être soigneusement évaluée. L'étude des îlots d'insuline marquées avec des fluorochromes qui sont excités au-dessus de 750 nm n'a pas encore été possible de nous en utilisant le lampe aux halogénures métalliques que notre jeu utilise le haut. Il est possible que d'un appareil photo avec une efficacité quantique encore plus élevée dans les longueurs d'onde pertinentes en combinaison avec d'autres sources lumineuses (diodes laser, par exemple) pourraient augmenter le potentiel de NIR-OPT loin et permettre à l'imagerie des longueurs d'onde encore plus élevés.
OPT est une technique d'imagerie très polyvalent pour les évaluations spatiales et quantitatives des échantillons biomédicaux à l'échelle mm-cm. Bien que les protocoles présentés ici ont été développées dans le but principal du pancréas / recherche sur le diabète, ils devrait être possible de traduire la recherche sur d'autres espèces, les types d'échantillons et des marqueurs. Par la possibilité de visualiser plusieurs chaînes distinctes dans des préparations pancréatiques intacts, NIR-OPT imagerie futres a le potentiel comme outil pour évaluer la spécificité absorption d'agents de contraste destinés à l'évaluation non invasive par d'autres modalités d'imagerie, pour autant que ces agents de contraste pourrait être conçu pour transporter aussi un fluorophore détectable par l'OPT.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. P. Lindström est reconnu pour fournir des souris ob / ob. J. Lehtonen est reconnu pour l'aide à la production vidéo et J. Gilbert de l'aide à l'édition. Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation Diabetes Research Institute (AP), la Juvenile Diabetes Research Foundation (AP et UA), la Commission européenne (FP-7, un accord de subvention n °:. CP-IP 228933-2) (JS et UC), les Fondations Kempe, Umeå University et le Conseil de recherche suédois d'UC
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
| Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
| Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
| Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |
References
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- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
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