Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi
Summary
Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri açıklamak<em> Candida albicans</emMakrofajlar tarafından> fagositoz. Bu yöntemler makrofaj migrasyon, tanıma, yutulma ve phagosome olgunlaşma aşamasına özgü analizine imkan ve fagositoz romanı yönlerden ortaya koymuştur.
Abstract
Fungal patojenler, ve daha genel olarak mikroorganizmaların Fagositik klirensi, dört ayrı aşamadan oluşur kabul edilebilir: patojenler bulunduğu siteye fagositler (i) göç; desen ile patojen ilişkili moleküler şekilleri (PAMPs) (ii) tanıma tanıyan reseptör (PRR); fagosit hücre zarı bağlı mikroorganizmalar (iii) yutulma ve olgunlaşan phagosomes ve yutulur parçacığın sindirimi içinde yuttu hücrelerin (iv) işleme. Kendi bütünlüğü içerisinde fagositoz değerlendirmek çalışmalar, 1, 2, 3, 4, 5, bilgilendirici olmakla birlikte, normal olarak farklı şekilde etkilenebilir göçü, yutulma ve phagosome olgunlaşma, içine işlem bozulmazlar ki içinde sınırlıdır. Ayrıca, bu tür çalışmaların tek bir olay olarak değil, sürekli bir dinamik bir süreç olarak alımını değerlendirmek. Biz son zamanlarda gelişmiş canlı hücre görüntüleme teknolojileri geliştirmiş, hem genetik fonksiyonel analizi ile bu kombine varpatojen ve konak hücreleri doğuştan gelen bağışıklık hücre fonksiyonu ve fungal patogenezi analizi için disiplinler arası bir platform oluşturmak. Bu çalışmalar sadece insan fagositler ve fungal patojenler ve daha genel olarak bulaşıcı mikroorganizmaların arasındaki moleküler ve hücresel etkileşimleri sistematik zamansal analizi kullanılarak gözlenebilir fagositoz romanı yönlerini ortaya koymuştur. Örneğin, aşağıdaki tanımlamak başladı: (a) hücre yüzeyinde bileşenleri tanınması, yutulma ve mantar hücreleri 1, 6, 7, 8 ve öldürme işleminin her bir aşama için gereken, (b) kadar yüzey geometrisini makrofaj alımını ve maya hücreleri ve hifal 7 öldürme etkinliği etkiler, ve (c) yutulma hücre döngüsü ve makrofajlar 9, 10, davranış değişikliği yol açar nasıl.
Tek bir zaman noktasında anlık aksine, canlı hücre görüntü mikroskopi eş olarak incelenmesi için konakçı hücreler ve patojenlerin geniş bir yelpazede sağlarhücre migrasyonu, replikasyonu ve veziküler kaçakçılığı da dahil olmak üzere dinamik süreçleri, geniş bir yelpazede üzerinde mekansal ve zamansal bilgi sağlayarak uzun süreler boyunca ntinuous dizileri. Burada ana ve mantar hücreleri hazırlamak ve video mikroskopi deneyler için nasıl ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu yöntemler diğer fagositler ve mikroorganizmalar ile ileride yapılacak çalışmalar için bir kullanıcı kılavuzu sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, makrofaj fagositozu incelemek için canlı hücre görüntü mikroskopi kullanımı için bir yöntem tarif edilmektedir. Video mikroskopi analizi için birden çok bilgi ek katmanlar sunuyor. Bir temel avantajı, verilerin alımını 6 saatlik gözlem süresi boyunca her bir zaman noktası için (tek bir deneyden elde) elde edilebilir olmasıdır. Daha da önemlisi, tarif edilen yöntem fagositozunu, tek aşamaları diferansiyel analizine olanak sağlar. Bu, örneğin, göstermiştir ki, C. toplam alımı değişiklikleri makrofaj hücre hatları ve birincil makrofajlar tarafından albicans glikozilasyon ve morfonogenezi mutantlar hücre-hücre teması kez hedef hücre veya yutulma oranı doğru makrofaj migrasyon değişiklikleri 7 kurulan ya bir sonucu olabilir.
Bu deneyler sırasında önlemek için tuzaklar bir vardır. İlk olarak, bu deney prosedürü boyunca sabit çevre koşulları sağlamak için çok önemlidirDure. Bu, en iyi şekilde bir kaç saat deney başlamadan önce deneysel koşullar için ayarlanmış bir çevresel bölme içinde elde edilir. Video kalite z-pozisyonu ne olursa olsun, böylece manuel odaklama düzeltmeler için ihtiyacı ortadan kaldırarak mekanik veya termal değişikliklerin otomatik numune korumak için kızılötesi lazer kullanır gelişmiş modülleri büyük ölçüde bağımlıdır.
Deneylerin genişletilmiş doğası göz önüne alındığında, düşük pozlama süreleri kolaylaştıracak yüksek floresan belirteçleri, kullanılarak minimize edilebilir lazer ışığına maruz kalınmasına ve ilişkili photobleaching ve photoconversion etkileri sınırlamak için önemlidir. Burada anlatılan FITC boyama protokolü, hızlı ve güvenilir. FITC olduğu gibi çok parlak ve istikrarlı bir leke, düşük pozlama süreleri gereklidir ve bu uzun zaman atlamalı filmleri için FITC idealdir vardır. Bununla birlikte, rutin Calcofluor beyaz PKH ve boyalar gibi etiketlenmiş organizmalar da dahil olmak üzere çeşitli hedef lekeleri çeşitli kullanın.
<p class = "jove_content"> Bizim yayınlanan çalışmaların çoğu geniş bir alan mikroskobu kullanılarak yapılır, ancak pozlama ayrıca bir iplik disk konfokal mikroskop kullanarak ve bizim elimizde bu time-lapse 3D video mikroskopi için esastır minimize edilebilir.Bu çalışma sırasında, görüntüleri 6 saat fagositoz tahlil fazla 1 dakika aralıklarla ele geçirildi. Görüntüler arasındaki aralığı soruşturma sürecine bağlı olarak ayarlanabilir. Bu tür veziküler ticareti gibi hızlı süreçlerin araştırılmasına Örneğin, aralık azaltılabilir. Minimum zaman aralığı mikroskop ve kamera özellikleri ile sınırlı olacaktır. Zamanlamaları ayarlarken akılda tutulması gereken bazı hususlar vardır. İlk olarak, anlık arasındaki süreyi azaltarak daha az puan imaged olabilir ve dosya boyutunu önemli ölçüde artmış olacak anlamına gelecektir. Tersine, çok fazla sayıda görüntü aralığını uzatan film süreklilik kaybettirirler.
Bu yaklaşım uygulanabilirilke olarak, diğer patojenler ve konak hücreleri ölüyor alımını çalışma. Örneğin, son zamanlarda sialoadhesin-eksik farelerde kemik iliği kaynaklı makrofajlar büyük sialylated Campylobacter jejuni 8 bağlayıcı ve fagositoz azalır sergilenirken göstermiştir. Görüntü analizi hedef hücre boyutu bir azalma ile giderek zorlaşır Ancak, hedef boyutu, fizibilite için önemli bir belirleyicisidir. Sofistike görüntü analiz yazılımı hızlı Video mikroskop analizi için önemlidir ve bu 7 ayrı hücreleri ve tüm hücre göçlere çalışma algoritmaları nesil kolaylaştırmak için uygun biyoinformatik desteği ile birlikte olmalıdır. Göç ve bireysel makrofaj-C.albicans etkileşimlerin dakika-by dakika analizi için gelişmiş görüntü analizi yazılımı ile birlikte canlı hücre Video mikroskobu, C. karmaşıklığı içine benzersiz bir fikir verir macrophag tarafından albicans fagositozues. Diğer patojenler ve fagositler (dendritik hücreler, nötrofiller) incelemek ve daha detaylı ya da epitel ve endotel hücre katmanları gibi daha fizyolojik yüzeylerde görüntü hücre-hücre etkileşimleri 3B video mikroskobu geliştirmek için bu yöntemleri genişletmek için büyük bir potansiyel var. Bu teknik, konak-patojen etkileşimleri çalışma araçları yeni nesil bir parçasıdır ve dinamik süreçleri geniş bir yelpazede üzerinde ayrıntılı mekansal ve zamansal bilgi üretmek yardımcı olacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE bir İskoç Kıdemli Klinik Fellow ve Baş Bilim Ofisi (SCD/03) desteğiyle kabul eder. Bu eser LPE (089930) için Wellcome Trust Projesi Hibe tarafından finanse edildi. NARG Bir Wellcome Trust Programı Hibe (080.088) ve bir ekipman Grant (075.470) (DeltaVision için), tarafından ve FP7-2007-2013 Grant (SAĞLIK-F2-2010-260338-Allfun) tarafından finanse edildi. Biz yardımcı destek ve tavsiye için özellikle Kevin MacKenzie Aberdeen görüntüleme tesisi Üniversitesi, teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -. P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
