מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים
Summary
אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי מתא<em> קנדידה אלביקנס</em> Phagocytosis ידי מקרופאגים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח שלב ספציפי של macrophage הגירה, הכרה, בליעה והתבגרות phagosome ולחשוף היבטי רומן של phagocytosis.
Abstract
אישור Phagocytic של פתוגנים פטרייתי, ומיקרואורגניזמים אופן כללי יותר, עשוי להיחשב מורכב מארבעה שלבים ברורים: הגירה (ט) לphagocytes לאתר שבו נמצאים פתוגנים (ii) זיהוי תבניות מולקולריות הפתוגן הקשורים (PAMPs) באמצעות דפוס קולטנים הכרה (PRRs), (iii) בליעת מיקרואורגניזמים המאוגדים לקרום תא תא בלען ועיבודים (iv) של תאים שרויים בתוך phagosomes ועיכול של חלקיקי בלע התבגרות. מחקרים שהערכת phagocytosis בשלמותו הם אינפורמטיבי 1, 2, 3, 4, 5, אבל הם מוגבלים בכך שהם בדרך כלל לא לשבור את התהליך לתוך הגירה, בליעה והתבגרות phagosome, שעשוי להיות מושפעות באופן דיפרנציאלי. יתר על כן, מחקרים מסוג זה להעריך ספיגה כאירוע בודד, ולא כתהליך דינמי מתמשך. פתחנו לאחרונה טכנולוגיות הדמיה לחיות סלולריות מתקדמות, ושלבנו אותם עם ניתוח פונקציונלי גנטי של שניהםתאי פתוגנים ומארח כדי ליצור פלטפורמת צולבות משמעת לניתוח תפקוד חיסוני מולד תא ופתוגנזה פטרייתי. מחקרים אלו גילו היבטי רומן של phagocytosis שרק יכולים להיבחן באמצעות ניתוח זמני שיטתי של אינטראקציות המולקולריות ותאיות בין phagocytes אדם ומזיקי פטריות ומיקרואורגניזמים מידבקים יותר בדרך כלל. לדוגמה, התחלנו להגדיר את הפעולות הבאות: (א) מרכיבי תא השטח נדרש לכל שלב בתהליך של הכרה, חנק והרג של תאים פטרייתיים 1, 6, 7, 8 (ב) כיצד גיאומטרית משטח משפיע על יעילות קליטת מקרופאג והרג של תאי שמרים וhyphal 7; ו( ג) כיצד היבלעות מובילה לשינוי של מחזור התא וההתנהגות של מקרופאגים 9, 10.
בניגוד לתמונות נקודת זמן בודדות, מיקרוסקופי וידאו חי תאים מאפשר מגוון רחב של תאים פונדקאים ופתוגנים להיחקר כשותףרצפי ntinuous בפרק זמן ממושך, המספקים מידע מרחב ובזמן במגוון רחב של תהליכים דינמיים, כולל נדידת תאים, שכפול וסחר פוחי. כאן אנו מתארים בפירוט כיצד להכין מארח ותאים פטרייתי, וכדי לבצע את ניסויי מיקרוסקופיה וידאו. שיטות אלה יכולים לספק למשתמש מדריך למחקרים עתידיים עם phagocytes ומיקרואורגניזמים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה השיטה לשימוש במיקרוסקופ וידאו חי תאים ללמוד phagocytosis macrophage מתוארת. מיקרוסקופיה וידאו מציעה רבדים נוספים רבים של מידע לצורך הניתוח. יתרון בסיסי אחת הוא שנתוני ספיגה יכולים להיות שנוצרו (מניסוי בודד) עבור כל נקודת זמן לאורך התקופה של 6 שעתי התצפית. וחשוב יותר, בשיטה המתוארת מאפשרת ניתוח הפרש של השלבים הפרטניים של phagocytosis. יש לנו, למשל, הראה כי שינויים בספיגה כוללת של ג glycosylation קנדידה ומוטנטים המורפוגנזה ששורות תאים macrophage ומקרופגים העיקריים יכולות להיות כתוצאה משינויים בהגירת macrophage כלפי תאי מטרה או שיעור של בליעה פעם קשר תאי תאים היא הוקמה 7.
ישנן מספר המלכודות להימנע בעת ביצוע ניסויים אלה. ראשית, חשוב מאוד על מנת להבטיח תנאים סביבתיים יציבים לאורך proce הניסיוני דורה. זו מושגת הטובה ביותר בחדר סביבתי שנקבע לתנאי הניסוי כמה שעות לפני תחילת הניסוי. איכות וידאו תלויה מאוד במודולים מתוחכמים המשתמשים בלייזרים אינפרא אדומים כדי לשמור באופן אוטומטי מדגם Z-עמדה ללא קשר לשינויים מכאניים או תרמית ובכך לחסל את הצורך בתיקוני מיקוד ידני.
בהתחשב באופי הארוך של הניסויים, חשוב להגביל את חשיפת אור ליזר ואפקטי photobleaching וphotoconversion קשורים, שניתן למזער על ידי העסקת סמני ניאון גבוה, המאפשרים זמני חשיפה נמוכות. הפרוטוקול המכתים FITC המתואר כאן הוא מהיר ואמין. כFITC הוא פעמים בהירות מאוד ויציבות כתם, נמוכות חשיפה נדרשות וזה הופך אידיאלי FITC לסרטים ארוכים זמן לשגות. עם זאת, אנו משתמשים באופן שגרתי במגוון של כתמי היעד שונים, כולל צבעי PKH Calcofluor לבן וכמו גם אורגניזמים מתויגים.
<p cילדה = "jove_content"> רוב העבודה שלנו פורסמה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב, אך ניתן למזער חשיפה נוספת באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב בידות שלנו וזה חיוני למיקרוסקופיה וידאו 3D זמן לשגות.במהלך מחקר זה, תמונות שנתפסו במרווחי 1 דקות מעל assay phagocytosis 6 שעות. המרווח בין תמונות יכול להיות מותאם בהתאם לתהליך נחקר. לדוגמה, המרווח יכול להיות ירידה כאשר חוקרים תהליכים מהירים כגון סחר פוחי. מרווח הזמן המינימאלי יהיה מוגבל על ידי מפרטי מיקרוסקופ ומצלמה. יש כמה שיקולים שכדאי לזכור בעת כוונון תזמונים. ראשית, ירידה במרווח בין תמונות תהיה אומרת פחות נקודות יכולות להיות צלמה וגודל קובץ יהיה במידה ניכר. להיפך, להגדיל את מרווח התמונה יותר מדי יעשה את הסרט יאבד את הרצף.
גישה זו יכולה להיות מיושמתבעיקרון ללמוד פתוגנים וספיגה למות תאי מארח אחרים. לדוגמה, שהראינו לאחרונה כי מקרופאגים שמקורם של מח עצם מעכברים sialoadhesin-לקויים להפגין מופחתים מאוד מחייב וphagocytosis של קמפילובקטר jejuni sialylated 8. עם זאת, גודל היעד הוא גורם חשוב להיתכנות, כמו ניתוח תמונה הופך קשה יותר ויותר עם ירידה בגודל תא המטרה. תוכנת ניתוח תמונה מתוחכמת חיונית לניתוח מיקרוסקופי וידאו מהיר, וזה צריך להיות בשילוב עם תמיכה ביואינפורמטיקה המתאימה כדי להקל על הדור של אלגוריתמים ללמוד הגירה של תאים בודדים ואוכלוסיות שלמות של תאים 7. מיקרוסקופיה וידאו חי תאים בשילוב עם תוכנת עיבוד תמונה מתוחכמת לניתוח דקה אחרת דקה של הגירה ואינטראקציות אישיות macrophage-C.albicans, מספקת תובנה ייחודית המורכבות של ג phagocytosis קנדידה ידי macrophages. יש פוטנציאל עצום להרחבה בשיטות אלה כדי ללמוד פתוגנים וphagocytes (תאים דנדריטיים, נויטרופילים) אחרים ולפתח מיקרוסקופיה וידאו 3D לאינטראקציות תא תאי תמונה בפירוט רב יותר, או על משטחים פיסיולוגיים נוספים כגון שכבות תאי אפיתל ואנדותל. טכניקה זו היא חלק מהדור הבא של כלים בחקר אינטראקציות המארח פתוגן ותעזור להפיק מידע מרחב ובזמן מפורט על מגוון רחב של תהליכים דינמיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE הוא עמית קליני בכיר סקוטי ומודה לתמיכה של לשכת המדען הראשית (SCD/03). עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome הפרויקט גרנט לLPE (089930). NARG מומן על ידי קרן Wellcome תכנית גרנט (080088) וציוד גרנט (075470) (לDeltaVision), ועל ידי FP7-2007-2013 גרנט (בריאות-F2-2010-260338-ALLFUN). ברצוננו להודות לאוניברסיטה של מתקן הדמית אברדין, בקווין מקנזי בפרט, על תמיכה ועצות מועילות.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -. P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
