Descrevemos métodos para live-célula vídeo de microscopia<em> Candida albicans</em> A fagocitose por macrófagos. Esses métodos permitem estágio específico de análise, migração de macrófagos, imersão, o reconhecimento e a maturação do fagossoma e revelar novos aspectos da fagocitose.
Apuramento fagocítica de fungos patogénicos e microrganismos, de modo mais geral, podem ser considerados para consistir de quatro fases distintas: (i) a migração dos fagócitos para o local onde estão localizados os patógenos, (ii) reconhecimento do agente patogénico padrões moleculares associados (PAMPs) através do padrão receptores de reconhecimento (PRRs), (iii) imersão de microorganismos ligados à membrana celular dos fagócitos, e (iv) de processamento de células englobadas dentro de fagossomos vencimento e digestão da partícula ingerida. Estudos que avaliam a fagocitose na sua totalidade são informativas 1, 2, 3, 4, 5, mas são limitados na medida em que normalmente não se dividir o processo em imersão, migração e maturação do fagossoma, o que pode ser afectada diferencialmente. Além disso, estes estudos avaliar a absorção, como um evento único, e não como um processo dinâmico contínuo. Desenvolvemos recentemente tecnologias avançadas vivo de células de imagem, e combinaram estes com a análise funcional de ambos genéticacélulas de patógenos e de acolhimento para criar uma plataforma inter-disciplinar para a análise da função da célula imune inata e patogenicidade. Esses estudos têm revelado novos aspectos de fagocitose, que só poderia ser observados usando análise temporal sistemática das interações celulares e moleculares entre fagócitos humanos e fungos e microorganismos infecciosos em geral. Por exemplo, podemos ter começado a definir o seguinte: (a) os componentes da superfície da célula necessárias para cada fase do processo de imersão, o reconhecimento ea morte de células fúngicas 1, 6, 7, 8, (b) a geometria da superfície como influencia a eficiência de absorção de macrófagos e morte de células de levedura e hifa 7, e (c) como imersão leva a alterações do ciclo celular e no comportamento dos macrófagos 9, 10.
Em contraste com a de um único ponto de tempo de instantâneos, live-célula microscopia de vídeo que permite uma grande variedade de células hospedeiras e organismos patogénicos para ser estudado como coseqüências ntinuous em períodos de tempo longos, fornecendo informação espacial e temporal em uma ampla gama de processos dinâmicos, incluindo a migração celular, replicação e tráfico vesicular. Aqui descrevemos em detalhes como preparar hospedeiro e células fúngicas, e para realizar os experimentos de microscopia de vídeo. Estes métodos podem fornecer um guia para estudos futuros com outros fagócitos e microorganismos.
Aqui, o método para a utilização de células-vivo microscopia vídeo para estudar a fagocitose de macrófagos é descrito. Microscopia de vídeo oferece múltiplas camadas adicionais de informações para análise. Uma vantagem básica é que os dados de absorção pode ser gerada (a partir de uma única experiência) para qualquer ponto no tempo ao longo do período de observação de 6 horas. Mais importante, o método descrito permite a análise diferencial das fases individuais de fagocitose. Nós temos, por exemplo, mostra que as mudanças na absorção global da C. albicans glicosilação e mutantes morfogênese por linhas celulares de macrófagos e macrófagos primários pode ser uma consequência de mudanças na migração de macrófagos em relação às células-alvo ou de taxa de uma vez a imersão contacto célula-célula é estabelecida 7.
Há uma série de armadilhas a evitar quando condução desses experimentos. Primeiro, é muito importante para garantir a estabilidade das condições ambientais durante o procedimento experimentalDure. Este é o melhor alcançado em uma câmara ambiental que está definida para as condições experimentais várias horas antes de iniciar o experimento. A qualidade do vídeo é altamente dependente de módulos sofisticados que usam lasers infravermelhos para manter automaticamente a amostra z posição independentemente das alterações mecânicas ou térmicas, eliminando assim a necessidade de correções de foco manual.
Dada a natureza prolongada das experiências, é importante para limitar a exposição à luz do laser e efeitos associados fotobranqueamento e fotoconversão, que podem ser minimizados através da utilização de marcadores altamente fluorescentes, o que facilita baixos tempos de exposição. O protocolo de coloração FITC descrito aqui é rápida e fiável. Como FITC é um muito brilhante e estável de manchas, os tempos de exposição baixos são necessários e isso torna ideal FITC por longos time-lapse filmes. No entanto, habitualmente utilizam uma variedade de manchas alvo diferentes, incluindo calcofluor white e corantes PKH, bem como organismos marcados.
<p class = "jove_content"> A maioria do nosso trabalho publicado é realizada utilizando um microscópio de campo amplo, mas a exposição pode ser ainda mais reduzido por meio de um microscópio confocal disco giratório e em nossas mãos é essencial para lapso de tempo microscopia de vídeo 3D.Durante este estudo, as imagens foram captadas a intervalos de 1 min ao longo de um ensaio de fagocitose 6 hr. O intervalo entre as imagens podem ser ajustadas de acordo com o processo sob investigação. Por exemplo, o intervalo pode ser diminuído quando se investiga processos rápidos como o tráfico vesicular. O intervalo de tempo mínimo será limitada pelas especificações de microscópio e camera. Há algumas considerações a ter em conta quando se ajusta horários. Primeiro, diminuindo o intervalo entre os instantâneos vai significar menos pontos podem ser visualizados e tamanho do arquivo será aumentado consideravelmente. Pelo contrário, o aumento do intervalo de imagem muito irá fazer o filme perde a continuidade.
Esta abordagem pode ser aplicadaem princípio, para estudar outros patogénios e absorção de morte de células hospedeiras. Por exemplo, recentemente demonstrado que os macrófagos de medula óssea derivadas de camundongos deficientes sialoadhesin exibem muito reduzida de ligação e fagocitose de sialilado Campylobacter jejuni 8. No entanto, o tamanho do alvo é um importante determinante para a viabilidade, tal como a análise de imagens torna-se cada vez mais difícil com a redução do tamanho da célula-alvo. Software de análise sofisticada imagem é essencial para a análise rápida de vídeo microscopia, e isso deve ser acompanhado de suporte de bioinformática adequado para facilitar a geração de algoritmos para estudar a migração de células individuais e populações de células inteiras 7. Live-célula microscopia de vídeo em combinação com um sofisticado software de análise de imagem para a análise minuto-a-minuto da migração e individuais macrófagos C.albicans interações, fornece uma visão única sobre a complexidade da C. albicans fagocitose por macrophages. Há um enorme potencial para expandir estes métodos para estudar outros patogénios e fagócitos (células dendríticas, neutrófilos) e desenvolver a microscopia de vídeo 3D de imagem interacções célula-célula em maior detalhe ou em mais superfícies fisiológicos, tais como camadas de células epiteliais e endoteliais. Esta técnica é parte da próxima geração de ferramentas no estudo da interação patógeno-hospedeiro e vai ajudar a gerar informações detalhadas espacial e temporal em uma ampla gama de processos dinâmicos.
The authors have nothing to disclose.
LPE é Senior Fellow escocês Clínica e reconhece o apoio do Escritório Cientista Chefe (SCD/03). Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust Projeto Grant para EFL (089.930). Narg foi financiado pelo Wellcome Trust um Programa Grant (080.088) e um Grant equipamento (075.470) (para DeltaVision), e por um Grant FP7-2007-2013 (SAÚDE-F2-2010-260338-ALLFUN). Gostaríamos de agradecer à Universidade de Aberdeen instalação de imagem, em particular, Kevin MacKenzie, de apoio e conselhos úteis.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
NaOH | Sigma | S5881-500G |
Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
FITC | Sigma | F7250-1G |
Sodium carbonate | BDH | 301215M |
Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
PBS | Gibco | 18912-014 |
DMEM | Lonza | BE12-614F |
FCS | Life Technologies | 10106169 |
Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |