Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose
Summary
Wir beschreiben Methoden für Live-Cell-Video-Mikroskopie<em> Candida albicans</em> Phagocytose durch Makrophagen. Diese Methoden ermöglichen stage-spezifische Analyse der Makrophagen-Migrations-, Anerkennung, engulfment und Phagosomenreifung und zeigen neue Aspekte der Phagozytose.
Abstract
Phagozytische Abstand von pilzlichen Pathogenen und Mikroorganismen allgemein kann als aus vier verschiedenen Phasen bestehen: (i) die Migration von Phagozyten an den Ort, wo Krankheitserreger befinden, (ii) die Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) durch Muster Erkennungsrezeptoren (PRRs), (iii) engulfment von Mikroorganismen gebunden an den Phagozyten Zellmembran, und (iv) Verarbeitung des Reifung verschlungen Zellen innerhalb Phagosomen und Verdauung der eingenommenen Teilchens. Studien, die Phagozytose Beurteilung in seiner Gesamtheit sind informativ 1, 2, 3, 4, 5, aber begrenzt sind, dass sie in der Regel nicht zu brechen den Vorgang ab in die Migration, engulfment und Phagosomenreifung, die unterschiedlich betroffen sein. Weiterhin Messung solcher Studien Aufnahme als ein einziges Ereignis, und nicht als ein kontinuierlicher dynamischer Prozess. Wir haben vor kurzem erweiterten Live-Cell-Imaging-Technologien entwickelt und kombiniert haben diese mit genetischen funktionelle Analyse von sowohlErreger und Wirtszellen, um eine übergreifende Plattform für die Analyse des angeborenen Immunsystems Zellfunktion und Pathogenität von Pilzen. Diese Studien haben neue Aspekte der Phagozytose, die nur beobachtet, wenn systematische zeitliche Analyse der molekularen und zellulären Interaktionen zwischen menschlichen Phagozyten und pilzlichen Krankheitserregern und infektiösen Mikroorganismen allgemein werden konnte aufgedeckt. Zum Beispiel haben wir begonnen, folgendes zu definieren: (a) die Komponenten der Zelloberfläche für jede Stufe des Prozesses der Erkennung, engulfment und Tötung von Pilzzellen 1, 6, 7, 8 erforderlich, (b), wie Oberflächengeometrie Einfluss auf die Effizienz der Makrophagen Aufnahme und Tötung von Hefe und Hyphen Zellen 7 und (c) wie engulfment führt zu Veränderungen des Zellzyklus und das Verhalten der Makrophagen 9, 10.
Im Gegensatz zum einzigen Zeitpunkt Momentaufnahmen, ermöglicht die Live-Video-Mikroskopie Zelle eine Vielzahl von Wirtszellen und Pathogenen als Co untersuchendenntinuous Sequenzen über längere Zeiträume, eine räumliche und zeitliche Informationen über eine breite Palette von dynamischen Prozessen, einschließlich der Zellmigration, Replikation und Vesikeltransport. Hier beschreiben wir detailliert, wie Host-und Pilzzellen vorzubereiten, und die Video-Mikroskopie Experimente durchzuführen. Diese Methoden können eine Benutzer-Leitfaden für künftige Studien mit anderen Phagozyten und Mikroorganismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird das Verfahren für die Verwendung von lebenden Zellen zu Makrophagen Videomikroskopie Phagozytose zu untersuchen beschrieben. Video-Mikroskopie bietet mehrere zusätzliche Schichten von Informationen für die Analyse. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass die Aufnahme von Daten erzeugt werden (aus einem einzigen Experiment) für jeden Zeitpunkt während des Beobachtungszeitraums von 6 Stunden werden. Noch wichtiger ist, ermöglicht das beschriebene Verfahren differentiellen Analyse der einzelnen Phasen der Phagozytose. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass Veränderungen in der gesamten Aufnahme von C. albicans Glykosylierung und Morphogenese Mutanten durch Makrophagen Zelllinien und primäre Makrophagen kann entweder eine Folge von Änderungen der Makrophagen-Migrations-Richtung Zielzellen oder Rate von einmal engulfment Zell-Zell-Kontakt hergestellt 7 sein.
Es gibt eine Anzahl von Fallen zu vermeiden, wenn die Durchführung dieser Versuche. Erstens ist es sehr wichtig, um stabile Umgebungsbedingungen über den Versuchszeitraum Verfah sicherzustellenDure. Dies wird am besten in einer Klimakammer, die den experimentellen Bedingungen mehrere Stunden vor Beginn des Experiments eingestellt ist erreicht. Video Qualität ist stark abhängig von anspruchsvollen Module, Infrarot-Laser verwenden, um automatisch die Probe z-Position, unabhängig von mechanischen oder thermischen Veränderungen wodurch die Notwendigkeit für manuelle Fokussierung Korrekturen.
Angesichts der verlängerte Natur der Experimente ist es wichtig, Laserlicht ausgesetzt und die damit verbundenen Photobleichen und Photokonversion Effekte, die durch den Einsatz stark fluoreszierende Marker, die geringer Belichtungszeiten erleichtern minimiert werden kann, einschränken. Die FITC Färbung hier beschriebene Protokoll ist schnell und zuverlässig. Als FITC ist ein sehr helles und stabile Fleck, niedrige Belichtungszeiten erforderlich sind und dies macht FITC ideal für ausgedehnte Zeitraffer-Filme. Allerdings verwenden wir routinemäßig eine Vielzahl von verschiedenen Ziel-Flecken, einschließlich Calcofluor Weiß und PKH Farbstoffe sowie getaggt Organismen.
<p class = "jove_content"> Die meisten unserer veröffentlichten Arbeit wird unter Verwendung eines Weitwinkel-Mikroskop, sondern Exposition kann durch die Verwendung eines Spinning Disc konfokalen Mikroskop und in unseren Händen das ist wesentlich für Zeitraffer-3D-Video-Mikroskopie minimiert werden.Während dieser Studie wurden Bilder von 1 min Intervallen über einen 6 h Phagozytose Assay erfasst. Das Intervall zwischen den Bildern kann angepasst je nach Verfahren untersucht werden. Zum Beispiel kann der Abstand verringert, wenn die Untersuchung schnelle Prozesse, wie Vesikeltransport werden. Das minimale Zeitintervall wird von Mikroskop und Kamera Spezifikationen. Es gibt einige Überlegungen zu bedenken, beim Einstellen Timings. Zunächst wird die Verringerung der Abstand zwischen Snapshots bedeutet weniger Punkte abgebildet werden können und die Dateigröße erheblich erhöht werden. Im Gegenteil, wird die Erhöhung der Bild-Intervall zu viel machen den Film zu verlieren Kontinuität.
Dieser Ansatz kann angewendet werdenim Prinzip zu studieren anderen Krankheitserregern und die Aufnahme von sterbenden Wirtszellen. Zum Beispiel haben wir vor kurzem gezeigt, dass Knochenmark-Makrophagen aus Sialoadhesin-defizienten Mäusen erheblich weisen verminderte Bindung und Phagozytose von sialylierten Campylobacter jejuni 8. Jedoch ist Zielgröße eine wichtige Determinante für Durchführbarkeit als Bildanalyse wird zunehmend schwieriger mit einer Reduzierung der Zielzelle skalieren. Anspruchsvolle Bildanalysesoftware notwendig für schnelle Videomikroskopie Analyse, und dies sollte mit entsprechenden Bioinformatik Träger gekoppelt werden, um die Erzeugung von Algorithmen, um die Migration der einzelnen Zellen und ganzen Zellpopulationen 7 studieren erleichtern. Live-cell Videomikroskopie in Kombination mit anspruchsvollen Bildanalyse-Software für die von Minute zu Minute Analyse von Migration und individuellen Makrophagen-C.albicans Interaktionen, bietet einen einzigartigen Einblick in die Komplexität von C. albicans Phagozytose durch macrophages. Es gibt ein enormes Potenzial, um diese Methoden zu erweitern, um andere Krankheitserreger und Fresszellen (dendritische Zellen, Neutrophile) zu studieren und 3D-Video-Mikroskopie Bild Zell-Zell-Interaktionen näher oder mehr physiologischen Oberflächen wie Epithel-und Endothelzellen Schichten zu entwickeln. Diese Technik ist Teil der nächsten Generation von Werkzeugen in der Studie der Wirt-Pathogen-Interaktionen und wird dazu beitragen detaillierte räumliche und zeitliche Informationen über eine breite Palette von dynamischen Prozessen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE ist ein schottischer Senior Clinical Fellow und erkennt die Unterstützung des Chief Scientist Office (SCD/03). Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust Project Grant LPE (089.930) finanziert. NarG wurde von einem Wellcome Trust Programm Grant (080.088) und einer Ausrüstung Grant (075.470) (für DeltaVision), und durch eine FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010 bis 260.338-Allfun) finanziert. Wir würden gerne die University of Aberdeen Bildgebung Anlage, insbesondere Kevin MacKenzie, für hilfreiche Unterstützung und Beratung danken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
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