JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em> Caenorhabditis Elegans</em

Published: March 30, 2013
doi:
10.3791/50180
, , ,
1Center for Human Genetic Research and Department of Medicine,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Earth, Atmospheric, and Planetary Sciences,Massachusetts Institute of Technology

Summary

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het bestuderen<em> Caenorhabditis elegans</em> Lipide winkels. Een snelle, eenvoudige, bevestigen-kleuring procedure voor TL-lipide druppels beeldvorming maakt gebruik van de spectrale eigenschappen van de lipofiele kleurstof Nijl rood. Vervolgens geven we biochemische meting van triglyceriden en fosfolipiden met vaste fase extractie en gaschromatografie-massaspectrometrie.

Abstract

De nematode C. elegans heeft zich ontpopt als een belangrijk model voor de studie van bewaarde genetische pathways reguleren vetstofwisseling als het gaat om de menselijke obesitas en daarmee samenhangende ziekten. Verschillende eerdere methoden ontwikkeld voor de visualisatie van C. elegans triglyceride-rijke vetreserves hebben bewezen onjuist, met de nadruk cellulaire compartimenten anders dan lipide druppels. Andere methoden vereisen gespecialiseerde apparatuur, zijn tijdrovend, of leveren inconsistente resultaten. We een snelle, reproduceerbare, fixeermiddel gebaseerde Nile rood kleuring werkwijze voor de nauwkeurige en snelle detectie van neutrale lipidedruppels in C. elegans. Een korte fixatie in stap 40% isopropanol maakt dieren volledig doorlaatbaar Nile rood, die vervolgens wordt gebruikt om dieren vlek. Spectrale eigenschappen van deze lipofiele kleurstof laat het krachtig en selectief fluoresceren in het geelgroene spectrum wanneer in een lipide-rijke omgeving, maar niet meerpoolgebieden. Aldus kan lipidedruppels worden gevisualiseerd op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met eenvoudige GFP imaging mogelijkheid na een korte Nile kleuring stap in isopropanol. De snelheid, betaalbaarheid, en de reproduceerbaarheid van dit protocol maakt het bij uitstek geschikt voor high throughput schermen. We tonen ook aan een gekoppelde methode voor de biochemische bepaling van triglyceriden en fosfolipiden met behulp van gaschromatografie massaspectrometrie. Deze strengere protocol moet worden gebruikt als bevestiging van de resultaten verkregen uit de Nijl rode microscopische lipide vastberadenheid. We verwachten dat deze technieken nieuwe standaarden worden in het gebied van C. elegans metabole onderzoek.

Introduction

Behoud van de metabole routes tussen mensen en de nematode Caenorhabditis elegans maakt het een krachtige modelorganisme voor de studie van obesitas. Terwijl C. elegans niet adipocyten gewijd aan de opslag van vet, zoals bij zoogdieren, ze doen slaan triglyceriden in lipide druppels 1 en bezitten veel van dezelfde toezichthouders van vetopslag en energieverbruik 2,3. Om te testen op vetgehalte in C. elegans zijn verschillende werkwijzen voorgesteld met verschillende niveaus van gemak en succes. De eens zo gemeenschappelijk gebruik van fluorescerende, vitale kleurstoffen vier-zeven werd onlangs in twijfel getrokken, en deze reagentia bleken zich vlekken een compartiment verschilt van de belangrijkste vet opslagplaats van C. elegans 1,8-11. Fixeermiddel gebaseerde niet-fluorescerende kleurstoffen, zoals Sudan zwart en olie-rood-O, terwijl succesvol benadrukken lipidedruppels in de worm 12-14, niet zo groot dynamisch bereik hebben voor kwantificering als fluorescent kleurstoffen 8,13,15. Bovendien huidige methoden voor fixatie zowel fluorescerende en niet-fluorescerende kleurstoffen zijn tijdrovend en omvatten meerdere vries-dooi stappen en / of het gebruik van giftige chemicaliën 1,9,10. Het gebruik van specifieke BODIPY-gemerkt lipide analogen is gemeld lipidedruppels markeren bij toediening aan levende wormen met korte labeling 15. Maar dit is afhankelijk van de opname van de kleurstof en wordt daarom beïnvloed door C. elegans verwerking en metabolisme van BODIPY vetzuur analogen. Een gevestigde alternatief voor lipide-kleuring kleurstoffen is vrij label, coherent anti-Stokes Raman verstrooiing (CARS) of gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) microscopie, die gebruik maken van de karakteristieke vibrationele eigenschappen van lipide moleculen te visualiseren vetreserves 10,16, 17. Echter duur speciale apparatuur nodig voor deze methode en throughput laag op zijn best.

Om een ​​behoefte aan snelle, schaalbare analyses te vervullensis van neutrale lipiden winkels in C. elegans metabole onderzoek, introduceren we een nieuwe, zeer reproduceerbare methode van fixatief op basis van de Nijl rood lipide kleuring. Spectrale en fysisch-chemische eigenschappen van het lipofiele kleurstof Nile rood induceren geelgouden-spectrale verschuiving van de excitatie-emissiepiek, zodat het fluoresceren in het groene emissie spectrum wanneer in een lipide-rijke omgeving, maar niet meer poolomgevingen 18 , 19. Zo lipidedruppels kan worden gedetecteerd na eenvoudige kleuring door het gebruik van een groen fluorescerend eiwit (GFP) filter die voor fluorescentiemicroscopie. Het gemak en de betaalbaarheid van deze techniek maakt het bij uitstek geschikt voor high throughput schermen. We tonen ook aan een gekoppelde, rigoureuze methode voor de biochemische bepaling van triglyceriden en fosfolipiden met behulp van vaste fase extractie en gaschromatografie-massaspectrometrie. Biochemical lipide meting correleert met Nile red gebaseerde microscopische bepaling van C. elegans fat massa, en moet gebruikt worden als een bevestiging van de bevindingen met microscopische lipide vastberadenheid.

Protocol

1. Bereiding van Rechthoekige Amp / Tet (A / T) LB agarplaten en NGM IPTG RNAi Plates A / T platen moeten 1-4 weken vóór gebruik bereid en opgeslagen in het donker bij 4 ° C. Voor 1 L van media voeg 1 L gedeïoniseerd water, 32 g LB agar, 1,5 ml 2 M NaOH, en 2 g Bacto agar. Autoclaaf 40 min op vloeibare cyclus. Na afkoelen tot 60 ° C, 3 ml tetracycline en 0,5 ml ampicilline. Giet 45 ml van media in elke plaat. Bereid 96-well platen RNAi 3 dagen tot 2 weken op voorhand. Tot 25 96-wells platen RNAi giet, voor te bereiden 1 L van nematoden groei media (NGM): 1 L gedeïoniseerd water, 3 g NaCl, 17 g agarose en 2,5 g bactopepton. Autoclaaf vloeibare cyclus bij 121 ° C gedurende 40 min met een roerstaafje. Laat afkoelen en roer op een hete plaat op 60 ° C. Wanneer koel tot 60 ° C, voeg de volgende stockoplossingen: 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml cholesterol, 25 ml 1 M KH 2 </sub> PO 4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 200 mg / ml carbenicilline, en 5 ml 1 M IPTG (zie Materialen tabel recepten). Doseer 150 ul RNAi media in elke well van een platbodem-96-well plaat met een elektronische multichannel pipet. Vermijd luchtbellen. Houden media in een steriele roestvrij stalen houder ondergedompeld in een 60 ° C waterbad tijdens afgifte. Houd RNAi platen niveau tot agarose stolt. Platen kan worden gegoten tot 2 weken van tevoren opgeslagen bij 4 ° C. Dag 1 2. Stempel Frozen Library platen op Rectangular Amp / Tet (A / T) LB-agarplaten Warm A / T platen op kamertemperatuur, waardoor ze in het donker. Transfer 96-well platen RNAi bibliotheek van -80 ° C tot ijs drogen. Open de aluminium-afgedichte plaat in de buurt van een bunsenbrander. Steriliseren een 96-pin replicator door onderdompeling kunnen serieel (elk 10 sec) in 10% bleekmiddel, gedeïoniseerd H2O, 70% en ETOH gevolgd door het passeren van pennen door een vlam. Herhaal EtOH en vlam stap. Breng replicator op bevroren 96-well RNAi glycerol voorraad en zorg ervoor dat elke pen contact maakt met het oppervlak van elk putje. Stempel op A / T plaat, het tekenen van een kleine cirkel met een pin zonder deze te beschadigen agar oppervlak. Re-seal en terug te keren bibliotheek platen tot -80 ° C. Incubeer A / T platen gestempeld bij 37 ° C gedurende de nacht voor bacteriële groei. Dag 2 3. Overnachting Grow RNAi Bacteriële Klonen in Deep-well Blocks Verwijder A / T platen van 37 ° C en bevestigen bacteriegroei. Vul elke well van een 96-well deep-well blok met 1,5 ml LB met 200 ug / ml carbenicilline. Steriliseer 96-pins replicator (zie stap 2.3). Toepassing replicator naar de top van de A / T plaat en zorg kunnen contact maken met elk bacteriële kloon RNAi. Til replicator en dompel pennen in de deep-well blok. Swirl, en langzaam te verwijderen, waardoor certain niet aangrenzende wells besmetten. Seal blok met ademen-makkelijk film. Incubeer overnacht bij 37 ° C onder roeren (950 rpm in MT Infors Microtiteron II shaker, voorkeur of 250 rpm in een 25 mm worp schudincubator). Dag 3 4. Zaad RNAi Bacteriële Klonen op 96-well NGM RNAi Platen Verwijder 96-well platen RNAi van 4 ° C en opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder deep-well blokken en centrifugeer 10 minuten bij 4.000 x g. Snel omdraaien blokken in gootsteen om media af te voeren, en het stempel omgekeerd op keukenpapier om het overtollige media te elimineren. Onder een laminaire stroming kap, voeg 40 ui LB met 200 ug / ml carbenicilline aan elk putje en afdichting met steriele film. Terug blokken tot kamertemperatuur bacteriële gedurende 10 minuten te mengen pellets, pellets of handmatig door voorzichtig pipetteren resuspenderen. In de laminaire stroming kap, verwijder steriele film en overdracht bacteriën van diep-goed blokken op 96-well platen RNAi. Voeg 40 ul van geresuspendeerde bacteriën rijen 'A' en 'H', en 35 pl van alle andere rijen. Meer vloeistof wordt toegevoegd aan rand putjes van de 96-well plaat aan RNAi uitdrogen en barsten van de agarose voorkomen. Laat platen ontdekt te drogen in kap voor 4-6 uur, inspecteren regelmatig voor droogte. Droge bacteriën er helder, niet troebel. Cover, omkeren platen en overnacht incuberen bij kamertemperatuur. 5. Bereid een synchrone populatie van Worms Twee 10 cm platen met veel zwangere wormen worden gebruikt voor egg voorbereiding van iedere 6 96-well platen RNAi. Zorg wormen niet-uitgehongerde tenminste twee generaties (7 dagen). Bereid een synchrone populatie van L1 zoals eerder beschreven 20. Voor 20 ml bleekwateroplossing gebruiken bleekmiddel 4 ml, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml gedeïoniseerd H2O en 10 ml M9 buffer. Overnacht synchroniseren wormen in 10 ml M9 in een 15 ml sterielepolypropyleenbuis met rotatie bij 20 ° C. Dag 4 6. Voeg Worms aan RNAi Plates Centrifugeer egg preps op 3000 xg gedurende 1 minuut. Aspireren supernatant, weg te blijven van de pellet van L1 jongen. Resuspendeer in 5 ml M9 buffer met 0,0005% Triton X-100. Toevoeging van de kleine hoeveelheid detergent voorkomt wormen plakken aan de pipet en heeft geen effect op vet kleuring. Tel wormen onder een microscoop. Stel indien nodig de concentratie tot 10-15 wormen per microliter. In de laminaire stroming kap voor elke 96-well plaat worden uitgezet, voeg 75 pi geresuspendeerde wormen in elk putje van een rij van een ondiepe-well assay blok. Een manuele multichannel pipet 50-75 wormen in 5 ui in elke well van de 96-well platen RNAi. Laat platen te drogen in de kap voor 30 tot 60 minuten. Wanneer droog, onder een microscoop, moet wormen lijken te kruipen, niet spartelend. Grow wormen op RNAi-platenbij 20 ° C voor ~ 64 uur. Dag 7 7. Fix en Stain Worms in Nile Red Verwijder RNAi platen uit incubator. Onderzoek onder de microscoop en opnemen uitgehongerd of pak slaag (nat) putten uit te sluiten van verdere analyse, aangezien deze aandoeningen beïnvloeden vetmassa. Met een elektronische repeat pipet, voeg 150 ul PBS met 0,01% Triton X-100 aan elk putje van een plaat RNAi. Met een handmatige meerkanaals pipet, mix en overdrachtvloeistof met wormen de overeenkomstige rij in een 96-deep-well plaat PCR. Vermijd het verstoren van de agar. Herhalen voor een totaal van 300 pl wormen in PBS per putje. Wanneer vier platen overgedragen gecentrifugeerd platen bij 500 rpm gedurende 1 minuut. Zuig supernatant met een 96-pin vacuum aspirator, waardoor ~ 25 ul vloeibare en worm pellet aan de bodem van de put. Voeg 150 ul van 40% isopropanol aan elk putje aan dieren herstellen. Zorg ervoor dat de pipet op een hoog genoeg snelheid om worm te mengenpellet met 40% isopropanol. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Centrifugeer platen onbedekt bij 500 rpm gedurende 1 minuut. Zuig supernatant met een 96-pin aspirator of handmatig, waardoor alleen 25 ul 40% isopropanol + worm pellet aan de bodem van de put. Aan elke well 150 pi Nile red kleuroplossing vlak vóór gebruik: 6 pl Nile rood stock oplossing van 0,5 mg / ml in aceton per 1 ml 40% isopropanol. Afdichtplaat met niet-steriele klevende folie en vlekken in het donker gedurende ten minste 2 uur. 8. Wash en Image Worms op een High-throughput Microscoop Centrifugeer bij 500 rpm gedurende 1 minuut en zuig bijna 25 pl Nile red dye. Voeg 150 ul PBS met 0,01% Triton X-100 aan elk putje en slaan in het donker gedurende ten minste 30 minuten. Centrifugeer bij 500 rpm gedurende 1 minuut. Een 12-kanaals pipet, aspiratie dieren uit de bodem van elk putje met 2 x 7 pl lijstberoertes en bereid op een 96-well Teflon bedrukt glasplaatje. Voorzichtig, zonder het verwijderen van wormen, verwijdert 9,5 ul van PBS uit elk putje van de dia. Als uw glasplaatje niet direct passen in uw microscoop mount, moet een aangepaste machinaal bewerkte aluminium diahouder worden gebruikt om wormen te monteren. Langzaam onderste deksel slide op 96-well slide. Deze stap kan enige oefening om luchtbellen te vermijden of over te steken van wormen in andere bronnen. Secure hoeken met lijm tack. Afbeelding dia in helderveld en fluorescentie met een GFP / FITC filter in te stellen op een geautomatiseerde microscoop. De lipide-signaal photobleaches gemakkelijk dus het moet worden afgebeeld op een systematische manier in alle putjes, niet handmatig, als fotobleken zal leiden tot kunstmatige verschillen tussen putten. Voor meer informatie over de analyse, zie vertegenwoordiger Resultaten en discussie. 9. Biochemische Lipid Bepaling Met behulp van Solid Phase Extraction (SPE) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GC / MS) <p class="Jove_content"> Voor de validatie van lipiden gebaseerd op Nile rode fluorescentie gaschromatografie gevolgd door massaspectrometrie (GC / MS) kan worden uitgevoerd op vetzuurmethylesters (FAME) afgeleid van triacylglycerolen (TAG) en fosfolipiden (PL) van worm pellets. Stappen met betrekking tot organische dient te worden uitgevoerd onder een afzuigkap. Zorg moet worden genomen dat de lipiden worden gehouden onder stikstof beschermd tegen licht tijdens langdurige opslag of incubatiestappen want ze zijn erg kwetsbaar voor oxidatie. Worm pellets van 2.500-5.000 synchrone dieren worden gebruikt als input, exact bereid zoals hierboven behalve dat dieren gekweekt op 10 cm platen RNAi. Wassen 2.500-5.000 wormen elk 10 cm plaat met 10 ml M9-buffer in een 15 ml conische buis polypropyleen. Pellet wormen bij 500 xg gedurende een minuut, en nawassen pellet met 10 ml M9 buffer. Pellet dieren bij 500 x g. Verstuif waardoor 250 ui totaal volume, en ofwel bevriezen met vloeibare stikstof en bij -80 ° C onder stikstof for latere verwerking of ga direct. De worm pellet kan direct worden genomen om de 9,3 stap als triglyceride massa moet worden genormaliseerd om fosfolipide massa 8,13,21. Indien echter de onderzoeker wenst normalisatie naar eiwitgehalte of DNA inhoud, moet de worm pellet worden gesonificeerd de hoogste intensiteit in een badsonicator gedurende 10 min, 30 sec op, 30 sec uit bij 4 ° C. Als eiwit of DNA normalisatie gewenst, verwijderen van een 5 pl aliquot en bepaal totale eiwitconcentratie met een Bradford-reagens of dergelijke of totale DNA-gehalte na kolomzuivering met een UV spectrofotometer. Toevoegen wormen tot 1,5 ml 02:01 chloroform: methanol in een van schroefdraad borosilicaatglas buis. Alle verwerking van organische oplosmiddelen moet worden gedaan met behulp van glazen pipetten. Met een wiretrol 50 ul pipet 25 nM fosfolipide standaard in 50 pl en 16,7 nM triglyceride standaard in 50 pl. Beide normen moeten worden opgelost in 2:1 chloroform: methanol, afgedekt strak,en opgeslagen onder stikstof beschermd tegen licht in een -80 ° C vriezer om oxidatie te voorkomen. Cap met fenol-cap en vortex. Extract gedurende 1 uur bij RT, vortexen elke 15 min. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Overdracht onderste organische fase zonder karkassen naar een borosilicaat cultuur buis. Voeg 0,3 ml 0,9% NaCl, vortex en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 min. Overdracht onderste organische laag tot een nieuwe borosilicaat kweekbuis, waardoor zeker niet plaats via een van de waterfase. Droge organische fase onder stikstof. Beginnen vaste fase extractie (SPE) resuspenderen gedroogde lipide in 1 ml chloroform. Als alternatief voor gedetailleerde scheiding en analyse van verschillende lipide klassen, waaronder fosfolipide klassen, glycolipiden, sfingolipiden, diacylglycerolen, triacylglycerolen, vrije vetzuren en cholesterol esters, dunnelaagchromatografie zoals ontwikkeld door het lab in Watts C. elegans 22 kan in plaats van SPE. Lipiden kunnen ook be gescheiden door HPLC en fracties geanalyseerd met GCMS. Geavanceerde methoden voor het hele lipidome profilering door liquid-chromatography/MS (LCMS) kan ook worden gebruikt 23-26. Monteer silica SPE kolom SPE spruitstuk. Pre-equilibreren kolom met 3 ml chloroform. Toestaan ​​oplosmiddel stromen door de zwaartekracht. Plaats lipide monster in SPE kolom verzamelen doorstroming in een van schroefdraad borosilicaat buis van de eerste fractie (TAG fractie). De meeste neutrale lipiden zal komen door in deze eerste 1 ml doorstroming. Voeg 3 ml chloroform om volledig te elueren TAG fractie, het verzamelen van doorstroming in de TAG fractie buis. Verwijder en dop de eerste collectie buis, en te vervangen door een schone verzamelbuis. Elueren glycosfingolipiden met 5 ml van 9:1 aceton: methanol. We routinematig niet de vetzuursamenstelling analyseren van deze fractie, kan het echter waardevolle informatie en kunnen bewaard worden voor de bereiding van methylesters en vrije basen sfingoïde voor verdere analyse met behulpgespecialiseerde procedures verschillen van die van TAG en PL zoals eerder 27 beschreven. Vervang glycosfingolipiden verzamelbuis met een tweede schroefdraad borosilicaat verzamelbuis. Elueren fosfolipiden met 3 ml methanol (PL fractie). Fracties kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C op dit moment begrensd stevig onder stikstof. Droge gezuiverde lipiden onder stikstof. Het drogen, in een droge verwarmingsblok snelheid bij 33 ° C. Bewaar geen lipiden in gedroogde vorm, zoals ze zijn bijzonder gevoelig voor oxidatie in gedroogde toestand. Resuspendeer gedroogde lipide fracties in 2 ml 2% H 2 SO 4 in methanol door vortexen en incubeer overnacht stevig afgedekt in een 55 ° C waterbad Fames maken. Zorg moet worden genomen om absoluut geen water in de FAME reactie als dit zal sterk remmen derivatisering van lipiden. We hebben meer efficiënte derivatisering door incubatie 's nachts en de literatuur suggereert minder lipide oxidatie wordt bij lagere temperaturen During FAME bereiding 28. Een alternatieve en snelle werkwijze is 2 ml 2,5% H 2 SO 4 gebruiken in methanol en gedurende een uur bij 70 derivatiseren of 80 ° C 21,22,29. De volgende ochtend, uit bad, en laat afkoelen. Voeg 1,5 ml H 2 O (om de reactie te blussen) en 0,3 ml hexaan (de Fames halen) voor elke TAG en PL fractie. Schud krachtig en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Heel voorzichtig verwijderen alleen top hexaan laag met behulp van een standaard pipet of Pasteur pipet. Afvullen autosampler buis. Zorg ervoor dat u geen aangezuurde methanol op te nemen als dit de GC-kolom en MSD te vernietigen. Cap en load monsters op GC / MS. Het monster wordt overgebracht in hexaan om een ​​micro-insert Agilent buisje gesloten met een PTFE-silicone-PTFE schroefdop. Het wordt overgedragen aan de Agilent GCMS model 6890/5973N uitgerust met een Supelcowax-10 (24079) 30 meter, 250 micron fused silica capillaire kolom. Een microliter geïnjecteerd into een splitless inlaat ingesteld op 250 ° C en 13,33 PSI Ultrapuur Helium wordt een draaggas wordt gebruikt. Het protocol is als volgt run constant 1 ml per min: Stap Instructie Doel Temperatuur 1 Houd 2 min 150 ° C 2 Helling 10 ° C per min 200 ° C 3 Houd 4 min. 200 ° C 4 Helling 5 ° C per min 240 ° C 5 Houd 3 min. 240 ° C 6 Helling 10 ° C per min 270 ° C 7 Rust 5 min 270 ° C A 3 min solvent delay wordt gebruikt in de MSD om slijtage van de fil minimaliserenAment. Daarna worden massa tussen 50 en 550 Dalton gedetecteerd met de viervoudige set MS bij 150 ° C en de source ms ingesteld op 230 ° C, met een thermisch extra temperatuur van 270 ° C.

Representative Results

Een voorbeeld van een belichte plaat die is genomen door het vet kleuring workflow wordt getoond in Figuur 1. Specifieke controles ten behoeve van vet (daf-2 insuline-receptor RNAi), weinig vet (lpd-3-eiwit die nodig is voor lipide opslag korrels in de darm RNAi), klein en weinig vet (FASN-1 vetzuur synthase RNAi), en lege vector ( control) tonen de verschillen in fluorescentie intensiteit volgens de vetgehalten van de dieren en de overeenkomstige lipide bedragen bepaald met GC / MS analyse (Figuur 2). Merk op dat gen inactivations leiden tot ontwikkelingsachterstand gearresteerd, kleine dieren vaak zal blijken veel minder vet hebben dan volwassen controledieren, ongeacht of aansluiting op het vetmetabolisme (figuur 3). Secundaire analyses, met inbegrip van vlekken analyse en Lipidenbiochemie met SPE-GCMS van wild-type controle dieren van vergelijkbare ontwikkelingsfase moet worden gedaan om de geldigheid van zorgenkleine of ontwikkelingsachterstand gearresteerd positieve hits. Bij FASN RNAi-1 (Figuur 2), dieren aanhouding in hetzij de L2 of L3 larvestadium en hebben vet kleuring lager dan volwassen control RNAi, maar vergelijkbaar in overvloed voor L2-L3 stadium control RNAi dieren (vet vlek procent van de volwassen controle RNAi: 49,9 ± 4,5% voor FASN-1 RNAi en 20,2 ± 2,1% voor L2 controle RNAi, en 64,7 ± 1,3 voor L3 controle RNAi). Als alternatief, biochemische analyse toonde een lagere TAG / PL verhouding dan L2 stadium afgestemd N2 controledieren (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 voor FASN-1 RNAi en 46,1 ± 3,4 voor fase-gematchte controlegroep RNAi, P ≤ 0,05). Dus in dit geval kan worden bevestigd door biochemische analyse FASN-1 een rol in lipide opslag in plaats van een fase-specifieke verlaging van vetmassa heeft. De follow-up analyse van belichte wormen leunt zwaar op een computationele platform zoals Cell Profiler met behulp vande WormToolbox 30. Voor kleinere aantallen afbeeldingen, kan een algemeen beschikbare beeldanalyse platform, zoals ImageJ, vrij verkrijgbaar zijn bij de NIH, worden gebruikt. Voor onze analyse werden unieke Matlab scripts gebruikt om het goed te identificeren en vervolgens de lege putjes of met bubbels sluiten en kleine verontreinigingen onderscheiden van wormen. Handmatige kwaliteitscontrole nodig was voor afbeeldingen die zijn gemarkeerd voor uitsluiting om de redenen die hierboven vermeld. We vonden empirisch dat 90e percentiel intensiteit van de worm pixels over een goed, genormaliseerd tot worm gebied over een goed, voor zover verenigbaar metriek van vlekken intensiteit in alle stadia van de worm ontwikkeling (figuur 3). Het integreren van totale vetmassa over het gebied van de worm, integendeel, zou de neiging om gelijkwaardig scoren kleine heldere wormen met grote dim wormen. Omdat onze methode is totaal fluorescent signaal niet te integreren over het gebied van de worm, bij het nemen van een intensiteit percentiel, veranderingen in de worm grootte per se doen geent vooroordeel de intensiteit gemeten. In plaats daarvan worden de verschillen in de pixel intensiteitsverdeling gemeten. Ondanks dit, zijn duidelijke verschillen gezien in kleuren pixel intensiteitsverdeling tussen dieren van verschillende ontwikkelingsstadia, dus is het belangrijk om de gevolgen van RNAi naar elk gen tegen dieren met een vergelijkbare ontwikkelingsstadium (figuur 3). Gemiddelde variabiliteit tussen repliceert wordt getoond in figuur 4 aangegeven hoge reproduceerbaarheid van het vet kleuringswerkwijze. Merk op dat de sterkte van de werkwijze is sterk afhankelijk verkrijgen beeldkwaliteit voor elke plaat onder gelijkmatige verlichting omstandigheden en met dezelfde belichtingstijden en met minimale bellen, vuil of crossover van wormen in andere putjes. SPE werd uitgevoerd op vooraf gemengd gezuiverd voor aan de mate waarin TAGs kunnen worden gescheiden van PL (Figuur 5A) te bepalen. In deze analyse hebben we bereikt een 100% separation van TAG en PL, aangeduid als een totale afwezigheid van 17:0 vetzuren afkomstig van PL in de TAG monster en een overeenkomstige volledige afwezigheid van 13:0 vetzuren afkomstig van TAG in de PL monster (Figuur 5A). Zo SPE is zeer efficiënt te scheiden lipide klassen. Deze analyse geeft niet aan dat alle tags van verschillende ketenlengte zullen gelijkwaardig worden gezuiverd door SPE en gedetecteerd door GCMS met vergelijkbare efficiëntie. Het verzekert alleen TAG en PL lipiden in totaal volledig van elkaar gescheiden. Een monster GC-MS spoor van N2 wildtype dieren die door vaste fase extractie en FAME bereiding is weergegeven in figuur 5B. Zowel TAG en PL, kunnen pieken worden geïdentificeerd op basis van retentietijd en ouder en dochter ionen op het massaspectrum en het totale gebied onder de geïdentificeerde pieken genormaliseerd op het gebied van de respectievelijke interne standaarden. De genormaliseerde hoeveelheid TAG, het gebied te bepalenonder alle toppen van de TAG chromatogram, behalve de standaard 13:0, werden opgeteld en gedeeld door het oppervlak onder de piek 13:0. Ook de genormaliseerde totale bedrag PL, het oppervlak onder alle pieken, behalve de standaard 17:0 bepalen werden opgeteld en gedeeld door het oppervlak onder de piek 17:0. De genormaliseerde waarden voor de TAG en PL monsters worden vervolgens gebruikt om de uiteindelijke TAG / PL te berekenen voor het monster: Opgemerkt dat de gegevens van SPE-GCMS veel meer geavanceerde analyse van vetzuren in elke lipidenfractie dan simpele berekening van de totale TAG om PL verhouding mogelijk. Zo kan de onderzoeker integreren een piek die overeenkomt met een vetzuur en vergelijk de genormaliseerde overvloed in monsters (bijv. cERGELIJKING in N2 wild-type versus daf-2 RNAi het geïntegreerde gebied van de 18:0 piek gedeeld door het 13:0 standaard piek, genormaliseerd tot de totale PL massa gedeeld door PL 17:0 standaard pieken): Indien de onderzoeker kiezen, zou het ook mogelijk om het percentage van elk vetzuur in de TAG of PL fracties als een percentage van de totale hoeveelheid vetzuur gekwantificeerd (als voorbeeld 18:0 in de TAG-fractie in N2 wormen ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt = "Afbeelding 1" fo: inhoud-width = "3.25in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Typische workflow voor de algemene experiment. Dag 1, ingevroren bibliotheek RNAi platen gestempeld op Amp / Tet LB agarplaten en geïncubeerd bij 37 ° C. Dag 2, zijn Amp / Tet platen gebruikt om zaad vloeibare kweken van RNAi klonen in diepe put blokken. Dag 3 worden de bacteriën geconcentreerd door centrifugatie en overgebracht naar 96-well platen RNAi. Dag 4, L1 hatchling C. elegans worden toegevoegd aan RNAi platen in vloeistof en gedroogd. Dag 7, worden de dieren verzameld in vloeistof, gekleurd met Nile rood in 40% isopropanol, gemonteerd op 96-well Teflon slides en afgebeeld met een high-throughput microscoop. Figuur 2. Fixatief op basis van de Nijl rode vlekken belangrijke <em> C. elegans vetreserves. Vertegenwoordiger helderveld en GFP-fluorescentie beelden worden getoond van N2 wormen gevoed op FASN-1 (kleine, weinig vet), lpd-3 (laag vetgehalte), controle (lege vector), of daf-2 (vetrijke) RNAi klonen. Monsters werden behandeld volgens het protocol (schematisch in Figuur 1). Dieren gefixeerd, gekleurd in Nile rood, en verbeelde resulteren in vergelijkbare lipide niveaus zoals verkregen uit biochemische lipide meting. Isopropanol-vaste Nile red fluorescentieniveaus, verkregen uit ten minste 6 biologische replicaten, wordt in de eerste rij. Kwantitatieve triglyceride niveau, een afspiegeling is van de totale neutrale lipiden winkels bij normalisatie totale fosfolipide niveaus (TAG / PL), die van 4 biologische herhalingen, worden getoond in de tweede rij. Het is belangrijk op te merken dat de absolute kwantificatie bereikt van fixatief Nijl rode vlekken en biochemische lipide bepaling vaak niet perfect. In dit geval echter kwalitatiefsoortgelijke, FASN-1 (RNAi) meer verschillende triglyceride massa opzichte van controle door biochemische methoden dan aangegeven door microscopie heeft, lpd-3 is vergelijkbaar anders, en daf-2 (RNAi) is minder verschillende, hoewel alle verschillen zijn statistisch zeer significant en metingen waren zeer reproduceerbaar. De getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SEM (* P ≤ 0,01; ** p ≤ 0,0001 ten opzichte van controle, bepaald met ongepaarde, tweezijdige T-test bij gelijke variantie). Figuur 3. Vetmassa bepaald door fixatie Nile kleuring op verschillende larvale stadia. Dieren werden gegroeid op OP50 bacteriën en verzameld bij de L1, L2, L3, L4 en zwangere volwassenen ontwikkelingsstadia. Beelden werden gevangen genomen na fixatie kleuring en geanalyseerd met behulp van een aangepaste Matlab script om de 90 ste percentiel o te bepalenf pixel intensiteit over de geïdentificeerde worm gebied. Merk op dat de lipide niveaus van dieren sterk toenemen als het dier ontwikkelt van L2 tot L4 stadium en vervolgens licht afnemen als het dier begint calorieën leiden naar de proliferatie van de kiemlijn in het volwassen stadium. De getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 6-8 duplo (**, p ≤ 0,0001 opzichte van zwangere volwassenen, bepaald met ongepaarde, tweezijdige T-test). Figuur 4. Hoge reproduceerbaarheid over onafhankelijke biologische repliceert. Afgebeeld is een spreidingsdiagram van Nile rode fluorescentie-intensiteiten over biologische repliceert (n = 6-8). Voor elke herhaling worden alle waarden genormaliseerd op de gemiddelde intensiteit van de lege vector controle. De getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SEM (**, p ≤ 0,0001 ten opzichte van controle, bepaald met ongepaarde, tweezijdige T-test uitgaandegelijke variantie). Figuur 5. GC-MS chromatogrammen van SPE gescheiden normen en wild type TAG en PL overvloed. (A) GC-MS sporen getoond van de SPE scheiding van TAG en PL normen. Let op de volledige afwezigheid van 13:0 vetzuur in de PL trace en de overeenkomstige afwezigheid van het 17:0 vetzuur in de TAG trace, wijst op een volledige scheiding van TAG (tritridecanoin) van PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero -3-fosfo-(1'-rac-glycerol)). (B) Een vertegenwoordiger volledige spectrum van TAG en PL uit een steekproef van N2 wild type dieren gevoed vector control RNAi (HT115 bacteriën met L4440 lege vector RNAi). Een microliter monster werd geïnjecteerd in een Agilent 6890/5973N GCMS volgens het protocol, en de individuele pieken werden geïdentificeerd door retention tijd en hun massaspectra. Afkortingen: cyclo, cyclopropaan vetzuur; iso:. Iso-methyl vertakte keten vetzuren, GLA, gamma-linoleenzuur, ALA, alfa-linoleenzuur, DGLA, dihomo gamma-linoleenzuur, EPA, eicosapentaeenzuur Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

De gepresenteerde protocol zorgt voor snelle, grootschalige screening van lipiden in C. elegans, die gemakkelijk kan worden aangepast aan hoge doorvoer schermen. In tegenstelling tot eerder gebruikte werkwijzen die een langdurige fixatie stap in paraformaldehyde, gevolgd door verscheidene vries-ontdooi cycli 8,10 betrekken ons protocol is een eenvoudige 3-min fixatie in isopropanol. We hebben gevonden dat door kleuring C. elegans in 40% isopropanol, ze vrij permeabel Nile rood, zonder het gebruik van extra vries-dooi of fixatie stappen. Ook, zoals Nile rood fluoresceert in selectief hydrofobe compartimenten in het groene spectrum 18,19,31 geen ontkleuroplossing nodig. In totaal kunnen dieren worden genomen van RNAi platen in lood en klaar om de afbeelding dieren in iets meer dan 2,5 uur. Deze werkwijze is betrekkelijk goedkoop en met een hoge reproduceerbaarheid worden uitgevoerd. De werkwijze hangt niet af van het vermogen van C. elegans tot opname of concentraatde kleurstof, en dus niet dezelfde beperkingen als voeding gebaseerde methoden waarbij vitale kleurstoffen. Gezien reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van metingen, is de werkwijze geschikt voor het screenen van grote aantallen genen inactivations door RNAi. Als kwantificering van lipide niveaus gewenst is gebaseerd op fixatief Nijl rode vlekken, adviseren wij het gebruik van 4-6 biologische replicaten met de passende controles en de toegepaste statistische testen.

Het is waarschijnlijk dat veel gen inactivations wat leidt tot kleine dieren (als gevolg van RNAi klonen veroorzaakt vertraagde of gearresteerd ontwikkeling) zou komen van een scherm voor vet toezichthouders, ongeacht enig verband met het vetmetabolisme. Terwijl de beeldanalyse programma dat we goed voor wormen van verschillende formaten gebruikt door het normaliseren van de fluorescentie-intensiteit van de worm gebied, kunnen individuele onderzoekers ook willen overwegen het vergelijken van het vet vlekken niveaus van kleine dieren met het wild type dieren van vergelijkbare ontwikkelingsfase. In degeval van kleine of ontwikkelingsachterstand gearresteerd dieren met een schijnbaar geringe vetmassa, stellen we voor dat geen enkele modaliteit is voldoende om veranderde vetstofwisseling te tonen. Verschillende follow-up experimenten, waaronder SPE-GCMS kan nodig zijn om de lipide-regulerende functie van deze genen te bepalen. Voor bekende metabole regulator FASN-1, SPE-GCMS analyse werden gematched op ontwikkelingsgebied N2 L2 controledieren was het noodzakelijk de schijnbare vetarme fenotype gevonden vergeleken met volwassen controledieren drukken. Terwijl Nijl rood vet vlekken aangegeven lagere vetgehalte in vergelijking met volwassen RNAi, in vergelijking met fase-gematchte L2 controle RNAi dieren te controleren, werd geen duidelijk verschil zien. Derhalve gebruik van een tweede methode, di biochemische kwantificering van de TAG / PL verhouding moet worden vastgesteld dat FASN-1 is een echte regulator van vetmassa als FASN-1 RNAi is biochemisch onderscheiden van stage L2-gematchte controle RNAi dieren.

<p class = "jove_content"> Terwijl we presenteren beeldvorming en-verwerking voor een high-throughput platform, een conventionele rechtopstaande microscoop kan gemakkelijk worden gebruikt om foto's te maken van wormen gemonteerd op agarose pads 20 of op conventionele formaat Teflon bedrukte 8 tot 12 goed microscoopglaasjes . De enige beperking is dat als de groene fluorescentie van lipide druppels gekleurd met Nijl rode photobleaches snel, systematisch, uniforme blootstelling voorwaarden dienen te worden gebruikt om de vergelijkbaarheid tussen de beelden te garanderen. Wij vinden dat een volledig geautomatiseerde microscoop met uniforme beeldacquisitie voorwaarden het beste werkt om dit effect.

Een van de grote troeven van dit protocol is dat nadat de afbeeldingen zijn verzameld kunnen ze worden opgeslagen voor toekomstige re-analyse. Dezelfde beelden kunnen worden gebruikt voor lichaamsgrootte bepalen naast vetgehalte. Zoals computational's steeds geavanceerder, is het vooruitzicht voor enkele worm analyse genereren statistisch significante resultatenuit een enkele bron. Dus onze methode die high-throughput microscopie maakt gebruik heeft een aantal voordelen ten opzichte van gepubliceerd scherm methodieken die een Copas Biosort gebruiken om te kwantificeren fluorescerende signalen 32,33. Echter, de methoden zijn zeker gratis.

Nauwkeurige, biochemische bepaling van vetgehalte door SPE en GC / MS bevestigt de Nile rood kleuring van grote vetvoorraden in C. elegans. Hoewel de absolute kwantificatie bereikt van fixatief Nijl rode vlekken en biochemische lipide bepaling vaak niet perfect overeen, beide methoden produceren zeer reproduceerbare, statistisch significante resultaten die kwalitatief eens. Bovendien kan deze werkwijze worden aangepast aan de specifieke behoeften van individuele onderzoekers die kan verdere analyse van de afzonderlijke klassen van glycosfingolipiden, fosfolipiden of triglyceriden in verschillende monsters moeten voldoen. Er zij opgemerkt dat andere groepen andere technologie gebruikt than SPE aan lipide klassen voorafgaand aan de GC / MS 22 te scheiden. Dunnelaagchromatografie (TLC) en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) heeft voordelen boven SPE in opdat zij zich beter gescheiden afzonderlijke neutrale lipiden (bv. TAG, diacylglycerolen, vrije vetzuren en cholesterol esters) van polaire lipiden (fosfatidylcholine, fosfatidylethanolamine) en glycol-sfingolipiden. We SPE kiezen, want het vereist een minimum aan uitgangsmateriaal (2.500-5.000 wormen), het benadrukt de belangrijke lange-termijn energie winkels, tags, die het grootste deel van de neutrale lipide fractie 4, en is een snelle, waarvoor geen speciale apparatuur of platen. Benadrukt moet worden dat gebaseerd op standaard mengsels SPE scheidt volledig TAGs van PLS en is zeer reproduceerbaar en betrouwbaar (zie figuur 5A). Terwijl kwantificering en analyse van vetzuurmethylesters is een GC / MS, dit materiaal is algemeen beschikbaar, en zo niet lokaal kan samplesworden gegenereerd zoals hierboven en bij -80 ° C onder stikstof tot analyse door een medewerker of commerciële GC / MS dienst is aangebracht.

De GCMS uitvoer bevat een hoge-resolutie data op elk vetzuur binnen elke lipide soort. Dit maakt het mogelijk het gedetailleerde verschillen tussen de monsters vergeleken. Als voorbeeld kan de onderzoeker bepalen of de waarden van bepaalde vetzuren veranderden in overvloed sterker dan andere daf-2, lpd-3 of FASN-1 RNAi vector versus controle. Deze enorm krachtige tool kan dan ook gedetailleerde informatie over welke lipide soorten zijn in overvloed gewijzigd met een experimentele manipulatie.

Voor onze analyse hebben we meestal normaliseren TAG massa PL massa. Hoewel eiwit of DNA kan ook worden gebruikt om lipiden massa normaliseren na vaststelling van een aliquot van gesoniceerd worm pellet vinden we dat deze methoden onder intgedemineraliseerd of menselijke fouten tijdens alle pipetteren stappen en in monster door iedere extractie. Het is om deze reden dat we ervoor gekozen om PL massa in plaats daarvan te gebruiken als onze normeringsfactor. Onnatuurlijke normen bij de aanvang van het protocol (tritridecanoin voor TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) voor PL) worden uitgevoerd door alle stappen van de vaste fase extractie en FAME voorbereiding, en garanderen een kwantitatieve en representatieve herstel van zowel TAG en PL fracties. Dezelfde garantie kan niet worden uitgevoerd als onderzoekers gebruiken eiwit of DNA TAG massa te normaliseren. Wij zijn van mening PL naar de meest robuuste meter door om TAG te vergelijken aan de overkant van monsters, zoals het is eerder aangetoond dat PL alleen minutieus veranderd door dezelfde prikkel het realiseren van grote massa verschuivingen in TAG niveaus, bijvoorbeeld verlengde verhongering of meer lichaamsbeweging 34 – 36. PL wordt gedacht dat een structurele rol spelen, waardoor membraan vloeibaarheid en cellulaire integratiegrity en signalering rollen in plaats van als energie-opslag 37-39. In onze handen, de TAG / PL-verhouding het meest overeenkomt met wat wordt verkregen door fixatief op basis van lipide kleuring met Nijl rood, en is het eens met dat gevonden door andere groepen 21. Een alternatieve strategie wordt gebruikt door Watts laboratorium, waar het percentage lipide TAG berekend versus totale lipiden 9,22,29.

Het gebruik van niet-inheemse soorten TAG en PL standaard zorgt ervoor dat geen eigen vetzuren worden opgenomen in de berekening normalisatie. De keuze van ketenlengte is zuiver gebaseerd op de behoefte aan deze normen het niet interfereert met de massa spectra van natief vetzuren. We hebben gevonden dat vetzuren 13:0 en 17:0 best dienen om dit doel. Het is mogelijk, gezien de verschillende chemische eigenschappen van kortere keten vetzuren, dat onze onnatuurlijke vetzuren normen misschien niet representatief herstel van alle ketenlengte vetzuren of kettingen different verzadiging indices. Zo is het mogelijk dat tijdens SPE of GCMS we kunnen zien verschillen in de efficiëntie van zuivering of detectie van lipiden met verschillende ketenlengten. Gebaseerd op deze en de verschillende ionisatie van verschillende vetzuren in de GCMS, is het niet mogelijk om een ​​absolute uitspraak over de overvloed van elk vetzuur. Daarom hebben we alleen vergelijken tussen de monsters binnen een enkel experiment abundanties van een bepaalde vetzuren. Wilde men absoluut kwantificeren een vetzuur, een manier zou kunnen worden bereikt zou zijn om een monster bereid zoals hierboven behandeld met een bekende hoeveelheid van een stabiel isotoop gemerkte 13 C versie van deze of soortgelijke vetzuur uitgevoerd, zodat het kan onderscheiden op basis van gewicht van de bovenliggende ion in de MSD bijvoorbeeld. Omdat we alleen relatieve hoeveelheden lipide klassen of elk vetzuur onze 13:0 en 17:0 TAG PL normen dat doel voldoende, vergeleken bij minimale kosten tezorgen voor adequate en representatieve herstel van elke lipide klasse.

Tot dit punt, is er sprake van een gebrek aan consensus over de interpretatie van bepaalde resultaten van de verschillende methoden, en in welke de heersende methoden zou moeten zijn. Het algemeen moet worden opgemerkt dat geen enkele methode afzonderlijk ideaal geschikt voor vetmetabolisme in C. bestuderen elegans. Echter door meerdere screening en validatie modaliteiten kan men bereiken vertrouwen verkregen aan lipide regulerende genen. Zo zijn we van plan om ons protocol om als benchmark voor toekomstige werkzaamheden dienen op het gebied van C. elegans vet onderzoek.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen Michael Kacergis bedanken voor technische bijstand en Lianfeng Wu voor discussies en het lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een loopbaanontwikkeling onderscheiding van de NIH / NIDDK (K08DK087941 tot AAS), een NIH / NIDDK opleiding subsidie ​​(5T32DK007028 op ECP), de Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (voor AAS), en de Charles H . Hood Foundation Child Health Research Award (voor AAS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
96-pin replicator Nunc 250520
LB Agar US Biologicals L1500
Agarose Invitrogen 16500500
Mechanical Pipettors Biohit M Line M10, M100, M300
Electronic Pipettor Biohit E Line E1200
1 M KH2PO4 Sigma P0662 pH 6.0 Sterilized by Autoclaving
1 M MgSO4 Sigma M2643 Sterilized by Autoclaving
1 M CaCl2 Sigma C2661 Sterilized by Autoclaving
NaCl Sigma S5886
5 mg/ml Cholesterol Sigma C8667 In 100% Ethanol
200 mg/ml Carbenicillin US Biologicals C1100 Filter Sterilized 0.2 μ
1 M IPTG US Biologicals I8500 Filter Sterilized 0.2 μ
100 mg/ml Ampicillin Filter Sterilized 0.2 μ
5 mg/ml Tetracycline In 100% Ethanol
Bacto Agar BD 214040
96-well TC Plates BD-Falcon 353072 For 96-well RNAi
Rectangular A/T Plates Thermo Scientific 242811 For stamping RNAi
LB Media US Biologicals L1530 Prepared as per manufacturer instructions
96-well Deep Well Assay Blocks Corning Costar 3960 Rectangular V-bottom assay block
96-well Shallow Well Assay Block Corning Costar 3956 Round V-bottom assay block
Sterile Sealing Film VWR 89134-432
Aluminum Sealing Film Corning Costar 6570 Thermowell Sealing tape for 96-well plates
M9 Buffer See Hope et al.20 See recipe below
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Nile red Invitrogen N-1142
Isopropanol Fisher BP2632-4
96-pin aspirator VP Scientific VP177A-1
96-well Teflon Masked Microscope Slides Thermo Scientific Custom Can also order Trevigen 96-well Cometslide
96-well Gold-Seal Coverslides Thermo Scientific Custom Can also use second 96-well Cometslide
Deep-well PCR plate VWR 89049-178
Non-sterile adhesive film VWR 60941-070
High-Throughput Microscope Leica DM6000 fully automated with Prior 96-well stage With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective
Bath Sonicator Diagenode Bioruptor XL
Chloroform Sigma 366927-4L
Methanol Fisher Optima F456-4
Phospholipid Standard Avanti Polar Lipids 830456P 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)
Triglyceride Standard NuChek Prep T-135 tritridecanoin
Wiretrol 50 μl Pipet Fisher 21-176-3A Drummond Scientfic
Acetone Sigma 320110-4L
Sulfuric Acid Fisher A300-500
Hexane Fisher Optima H306-1
SPE Silica Column Thermo Scientific 60108-317 Hypersep SI, 100 mg resin bed
Solid Phase Chromatography Manifold Sigma 57265 Supelco Visiprep 24-DL
Borosilicate Pipets Fisher 13-678-27F 10 ml size
Borosilicate Pasteur Pipets Fisher 13-678-8B
Borosilicate Culture Tubes Fisher 14-961-27
Threaded Borosilicate Tubes VWR 14235-460 8 ml capacity
Phenolic Caps for Culture Tubes Fisher 14-823-211
GC/MS Autosampler Vials Agilent 5188-6592
Caps for Autosampler Vials Agilent 5185-5861
GC/MS Agilent 6890 GC / 5973 MSD Outfitted with a Supelcowax-10 column

Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
NaCl 3 g
Agarose 17 g
Bacto peptone 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
1 M MgSO4 1 ml
5 mg/ml cholesterol 1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6.0) 25 ml
1 M CaCl2 1 ml
200 mg/ml carbenicillin 1 ml
1 M IPTG 5 ml
Dispense into 96-well RNAi plates. Store at 4 °C until use, up to 2 weeks.

Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
LB agar (US Biologicals) 32 g
2 M NaOH 1.5 ml
Bacto agar 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
Tetracycline 3 ml
100 mg/ml Ampicillin 0.5 ml
Dispense 45 ml into each plate. Store in dark at 4 °C until use, up to 4 weeks.

LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks

Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy.

100 mg/ml Ampicillin

Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Tetracycline

Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container.

200 mg/ml Carbenicillin

Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Cholesterol

Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months.

1 M MgSO4

Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M CaCl2

Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M KH2PO4, pH 6.0

Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches

Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature.

10 N NaOH

Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature.

1 M IPTG

Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation

Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use.

Nile red stock solution

Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner.

Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates

Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use.

Phospholipid Standard

Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

Triglyceride Standard

Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
  3. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
  4. Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
  5. Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
  6. Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
  7. Wang, M. C., O’Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
  8. O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
  9. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
  10. Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
  12. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
  13. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
  14. McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
  15. Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
  16. Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
  17. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
  18. Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
  19. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  20. Hope, I. L. . C. elegans: A Practical Approach. , 304 (1999).
  21. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
  23. Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
  24. Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
  25. Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
  26. Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
  27. Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
  28. Christie, W. W. . Advances in Lipid Methodology – Two. , 69-111 (1993).
  29. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  30. Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
  31. Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
  32. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
  33. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
  34. Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
  35. Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
  36. Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
  37. Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
  38. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  39. Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).

Tags

Caenorhabditis ElegansLipid DropletsNile Red StainingHigh-throughput MicroscopyTriglyceridesPhospholipidsGas Chromatography-mass Spectrometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image