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Biology

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em> Caenorhabditis elegans</em

Published: March 30, 2013
doi:
10.3791/50180
, , ,
1Center for Human Genetic Research and Department of Medicine,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Earth, Atmospheric, and Planetary Sciences,Massachusetts Institute of Technology

Summary

Wir präsentieren robust biochemischen und mikroskopischen Methoden zur Untersuchung<em> Caenorhabditis elegans</em> Lipid-Shops. Eine schnelle, einfache Befestigung-Färbeverfahren für Leuchtstofflampen Lipidtropfen Bildgebung nutzt die spektralen Eigenschaften der lipophilen Farbstoff Nile rot. Wir haben dann präsentieren biochemische Messung der Triglyceride und Phospholipide mittels Festphasenextraktion und Gaschromatographie-Massenspektrometrie.

Abstract

Der Fadenwurm C. elegans wurde als wichtiges Modell für die Untersuchung der konservierten genetischen Signalwege reguliert den Fettstoffwechsel, wie es für die menschliche Fettleibigkeit und die damit verbundenen Krankheiten betrifft entstanden. Mehreren früheren Methoden zur Visualisierung von C entwickelt elegans triglyceridreichen Fettreserven haben sich als falsch herausgestellt, Hervorhebung zellulären Kompartimenten andere als Fetttröpfchen. Andere Methoden erfordern eine spezielle Ausrüstung, sind zeitaufwändig oder zu inkonsistenten Ergebnissen. Wir stellen eine schnelle, reproduzierbare, Fixiermittel-basierte Nilrot Färbemethode für die genaue und schnelle Erkennung von neutralen Lipid Tröpfchen in C. elegans. Eine kurze Fixierungsschritt in 40% Isopropanol macht Tiere vollständig durchlässig Nilrot, die dann verwendet wird, um Tiere zu färben. Spektralen Eigenschaften dieser lipophilen Farbstoff damit sie stark und selektiv fluoreszieren im gelb-grünen Spektrum nur, wenn in einer Lipid-reichen Umgebung, aber nicht in mehrpolaren Umgebungen. So kann Lipidtröpfchen visualisiert werden auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einfachen GFP-Imaging-Fähigkeit nach einer kurzen Nile rote Färbung Schritt in Isopropanol ausgestattet. Die Geschwindigkeit, Erschwinglichkeit und Reproduzierbarkeit dieses Protokolls machen es ideal für High-Throughput-Bildschirme geeignet. Wir zeigen auch ein gekoppeltes Verfahren zur biochemischen Bestimmung von Triglyceriden und Phospholipiden mittels Gaschromatographie Massenspektrometrie. Diese strengeren Protokoll sollte als Bestätigung der Ergebnisse aus der Nilrot mikroskopischen Lipid Bestimmung erhalten werden. Wir erwarten, dass diese Techniken neue Standards geworden im Bereich C. elegans metabolische Forschung.

Introduction

Erhaltung der Stoffwechselwege zwischen Menschen und dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist es ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung von Fettleibigkeit. Während C. elegans nicht Adipozyten gewidmet Fettspeicherung dergleichen bei Säugetieren, sie store Triglyceride im Lipidtröpfchen 1 und besitzen viele der gleichen Regulatoren der Fettspeicherung und Energieverbrauch 2,3. Um Assay für Fettgehalt in C. elegans wurden mehrere Verfahren mit unterschiedlichem Erfolg Leichtigkeit und vorgeschlagen worden. Die einst gemeinsame Verwendung von fluoreszierenden, Vitalfarbstoffen 4-7 wurde vor kurzem in Frage gestellt, und diese Reagenzien nachgewiesen werden Färbung ein Fach getrennt von der Haupt Fettspeicherung Depot C. elegans 1,8-11. Fixative-basierte nicht-fluoreszierende Farbstoffe wie Sudan schwarz und Oil-red-O, während erfolgreich Hervorhebung Fetttröpfchen in der Schnecke 12-14, nicht so groß ein Dynamikumfang haben zur Quantifizierung als FluoreszenzFluoreszenzfarbstoffen 8,13,15. Außerdem sind derzeitige Verfahren der Fixierung für beide fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Farbstoffen zeitaufwendig und beinhalten mehrere Gefrier-Auftau-Schritte und / oder die Verwendung von toxischen Chemikalien 1,9,10. Die Verwendung spezieller BODIPY-markiertes Lipid-Analoga wurde berichtet, dass die Fetttröpfchen zu markieren, wenn zu leben Würmer mit kurzfristigen Kennzeichnung 15 zugeführt. Doch diese stützt sich auf die Aufnahme des Farbstoffs und wird daher durch C. voreingenommen elegans Handhabung und Stoffwechsel von BODIPY-Fettsäure-Analoga. Eine etablierte Alternative zur Lipid-Färbung Farbstoffen ist Label-frei, kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) oder stimulierte Raman-Streuung (SRS) Mikroskopie, die die Vorteile der charakteristischen Schwingungen Eigenschaften von Lipid-Moleküle nehmen zu visualisieren Fettreserven 10,16, 17. Jedoch ist teuer spezialisierte Ausrüstung für dieses Verfahren notwendig ist, und ist im besten Durchsatz gering.

Um eine Notwendigkeit für eine schnelle, skalierbare Analyse zu erfüllensis von neutralen Lipid Filialen in C. elegans metabolische Forschung, stellen wir eine neuartige, hoch reproduzierbare Methode Fixativ-basierte Nilrot Lipid Färbung. Spektralen und chemischen Eigenschaften des lipophilen Farbstoff Nilrot induzieren eine goldgelbe-Spektralverschiebung in seiner Erregung-Emissionspeak, so dass sie in der grünen Emissionsspektrum fluoresziert nur, wenn in einer Lipid-reichen Umgebung, nicht aber in mehreren polaren Umgebungen 18 , 19. Somit kann nach der Lipidtröpfchen einfache Färbung durch die Verwendung eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-Filter für die Fluoreszenzmikroskopie gesetzt erkannt werden. Die Leichtigkeit und die Erschwinglichkeit von dieser Technik machen es ideal für High-Throughput-Bildschirme geeignet. Wir zeigen auch eine gepaarte, rigorose Methode zur Bestimmung der biochemischen Parameter der Triglyceride und Phospholipide mittels Festphasenextraktion und Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Biochemische Lipidmeßparameter korreliert mit Nilrot-basierten mikroskopische Bestimmung von C. elegans fat Masse und sollte als eine Bestätigung der Ergebnisse mit mikroskopischen Lipid Bestimmung gemacht werden.

Protocol

Ein. Vorbereitung der Rectangular Amp / Tet (A / T) LB Agar Platten und NGM IPTG RNAi Plates A / T Platten sollte 1-4 Wochen vor herstellen zu bedienen und in der Dunkelheit bei 4 ° C. Für 1 l Medien hinzufügen 1 L entionisiertem Wasser, 32 g LB-Agar, 1,5 ml 2 M NaOH und 2 g Bacto-Agar. Autoklavieren 40 min auf liquide Zyklus. Nach Abkühlen auf 60 ° C, 3 ml Tetracyclin und 0,5 ml Ampicillin. Gießen 45 ml Medium in jeder Platte. Bereiten Sie 96-well RNAi Platten 3 Tage bis 2 Wochen im Voraus. Auf 25 96er RNAi Platten gießen, bereiten 1 L Nematoden Wachstumsmedium (NGM): 1 L entionisiertem Wasser, 3 g NaCl, 17 g Agarose und 2,5 g Bactopepton. Autoclave flüssigen Zyklus bei 121 ° C für 40 min mit einem Rührstab. Abkühlen lassen, unter Rühren auf einer Heizplatte auf 60 ° C. Nach dem Abkühlen auf 60 ° C, fügen Sie die folgenden Stammlösungen: 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 5 mg / ml Cholesterin, 25 ml 1 M KH 2 </sub> PO 4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 200 mg / ml Carbenicillin und 5 ml 1 M IPTG (siehe Materialien Tisch für Rezepte). Dispense 150 ul RNAi Medien in jede Vertiefung einer Flachboden-96-Well-Platte mit Hilfe eines elektronischen Mehrkanalpipette. Luftblasen vermeiden. Halten Medien in einem sterilen Behältnis aus Edelstahl in einem 60 ° C Wasserbad eingetaucht, während Abgabevorrichtung. Halten RNAi Platten Niveau bis Agarose erstarrt. Platten können bis zu 2 Wochen gegossen werden im Voraus und bei 4 ° C. Tag 1 2. Stempel Gefrorene Bibliothek Platten auf Rectangular Amp / Tet (A / T) LB-Agarplatten Warm A / T-Platten auf Raumtemperatur, halten sie in der Dunkelheit. Transfer 96-well Platten RNAi Bibliothek von -80 ° C bis Trockeneis. Öffnen Sie die Aluminium-versiegelte Platte nahe einem Bunsenbrenner. Sterilisieren eine 96-pin-Replikator durch Eintauchen Pins seriell (10 sec jeweils) in 10% Bleichmittel, deionisiertes H 2 O und 70% EToh gefolgt, indem Stifte durch eine Flamme. Wiederholen EtOH und Flamme Schritt. Bewerben Replikator gefrorenen 96-well RNAi Glycerin Lager, um sicherzustellen, jeder Stift berührt die Oberfläche jedes gut. Stempel auf die A / T Platte, Zeichnen eines kleinen Kreis mit jedem Stift ohne Beschädigung Agaroberfläche. Re-Siegel-oder Rückgabebelehrung Bibliothek Platten bis -80 ° C. Inkubieren gestanzt A / T-Platten bei 37 ° C über Nacht für Bakterienwachstum. Tag 2 3. Wachsen RNAi Bakterienklone Übernachtung in Deep-Well-Blocks Entfernen A / T-Platten von 37 ° C ein und bestätigen das Bakterienwachstum. Füllen Sie jede Vertiefung einer 96-Well-Deep-Well-Block mit 1,5 ml LB mit 200 ug / ml Carbenicillin. Sterilisieren 96-pin-Replikator (siehe Schritt 2.3). Bewerben Replikator an der Spitze der A / T Platte, um sicherzustellen, Stifte Kontakt mit jedem bakteriellen RNAi-Klon. Heben Replikator und tauchen Stifte in den Deep-Well-Block. Swirl, und langsam entfernen, so dass certain nicht an benachbarte Brunnen verseuchen. Seal Block mit breathe-easy Film. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Rühren (950 rpm in MT Infors Microtiteron II Shaker, bevorzugten oder 250 rpm in einem 25 mm-Wurf Schüttelinkubator). Tag 3 4. Seed RNAi Bakterienklone auf 96-Well NGM RNAi Plates Entfernen 96-Well-Platten RNAi von 4 ° C und auf Raumtemperatur erwärmt. Entfernen Deep-Well-Blocks und zentrifugieren 10 min bei 4.000 x g. Schnell invertieren Blöcke in Waschbecken, Medien ablaufen, und stempeln invertiert auf Papier Handtuch überschüssige Medien zu beseitigen. Unter einer Sterilbank, fügen Sie 40 ul LB mit 200 ug / ml Carbenicillin in jede Vertiefung und Dichtung mit steriler Film. Zurück Blöcken auf Raumtemperatur bakterielle Schüttler für 10 min zu Pellets resuspendieren oder manuell resuspendieren Pellets durch sorgfältige Pipettieren. In der Laminarströmungshaube, entfernen sterile Film und Übertragung von Bakterien tiefWell-Blocks auf 96-Well Platten RNAi. Fügen Sie 40 ul der resuspendierten Bakterien Zeilen 'A' und 'H', und 35 ul von allen anderen Zeilen. Flüssigkeit mehr zu Kante Vertiefungen der 96-Loch-Platte zu RNAi Übertrocknung und Rissbildung der Agarose verhindern zugegeben. Lassen Platten abgedeckt sind, um in der Kapuze für 4-6 Stunden trocknen, Inspektion regelmäßig für Trockenheit. Dry Bakterien scheinen klar, nicht trübe. Cover, invertieren Platten und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. 5. Bereiten Sie eine Synchronous Bevölkerung von Worms Zwei 10 cm-Platten mit vielen gravid Würmern gefüllt sind für Ei Vorbereitung für alle 6 96er RNAi-Platten verwendet. Achten Sie darauf, Würmer sind nicht verhungert für mindestens zwei Generationen (7 Tage). Bereiten Sie eine synchrone Bevölkerung von L1 wie zuvor beschrieben 20. Für 20 ml Bleichlösung verwenden 4 ml Bleichmittel, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml deionisiertes H 2 O und 10 ml M9-Puffer. Synchronisieren Würmern über Nacht in 10 ml M9 in einem 15 ml sterilePolypropylenröhrchen mit der Drehung bei 20 ° C. Tag 4 6. Fügen Worms RNAi Plates Zentrifuge Ei preps bei 3.000 xg für 1 min. Absaugen des Überstandes, bleiben weg von dem Pellet von L1 Jungtiere. Resuspendieren in 5 ml M9-Puffer mit 0,0005% Triton X-100. Neben der geringen Menge an Waschmittel verhindert Würmer vom Kleben an der Pipette und hat keinen Einfluss auf Fettfärbung. Graf Würmer unter einem Mikroskop. Falls erforderlich, die Konzentration auf 10-15 Würmer pro Mikroliter. In der laminaren Strömung Kapuze, für jeden 96-Well-Platte auf ausgesät werden, fügen Sie 75 ul der resuspendierten Würmer in jede Vertiefung einer Reihe von flachen und Assay-Block. Mit einer manuellen Mehrkanalpipette, fügen 50-75 Würmer in 5 ul in jede Vertiefung der 96-Well-RNAi Platten. Erlauben Platten in der Haube für 30 bis 60 min trocknen. Nach dem Trocknen unter einem Mikroskop, sollte Würmer erscheinen zu kriechen, nicht verprügeln. Wachsen Würmer auf RNAi Plattenbei 20 ° C für ~ 64 Stunden. Tag 7 7. Fix und Malfarben Worms in Nile Red Entfernen RNAi Platten aus Inkubator. Untersuchen Sie unter dem Mikroskop und Aufzeichnung verhungert oder Prügel (wet) Brunnen aus der weiteren Analyse ausgeschlossen, da diese Bedingungen Fettmasse beeinflussen. Mit Hilfe eines elektronischen Repetierpipette, fügen Sie 150 ul PBS mit 0,01% Triton X-100 in jede Vertiefung einer RNAi Platte. Bei einer manuellen Mehrkanalpipette, mischen und Transfer Flüssigkeit mit Würmern auf die entsprechende Zeile in einer 96-Deep-Well-PCR-Platte. Verhindern, dass das Agar. Wiederholen Sie für eine Gesamtmenge von 300 ul Würmer in PBS pro Vertiefung. Wenn vier Platten übertragen wurden, zentrifugieren Platten bei 500 rpm für 1 min. Absaugen des Überstandes mit einem 96-poligen Vakuum Sauger, so dass ~ 25 ul Flüssigkeit und Wurm Pellet am Boden des Bohrlochs. Fügen Sie 150 ul von 40% Isopropanol in jede Vertiefung zu Tieren zu beheben. Stellen Sie sicher, dass Pipette befindet sich auf einem ausreichend hohen Geschwindigkeit auf Wurm mischenPellet mit 40% igem Isopropanol. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Zentrifuge Platten bei 500 UpM für 1 Minute freigelegt. Absaugen des Überstandes unter Verwendung eines 96-poligen Aspirator oder manuell, so dass nur 25 ul 40% Isopropanol + Wurm Pellet am Boden des Bohrlochs. Zu jedem gut, fügen 150 ul Nilrot Färbelösung unmittelbar vor Gebrauch hergestellt: 6 ul Nilrot Stammlösung von 0,5 mg / ml in Aceton pro 1 ml 40% Isopropanol. Seal Platte mit nicht-sterile Folie und Flecken in der Dunkelheit für mindestens 2 Stunden. 8. Wash und Image Worms auf einem High-Throughput-Mikroskop Zentrifuge bei 500 rpm für 1 min und saugen alle, aber 25 ul Nile roten Farbstoff. Fügen Sie 150 ul PBS mit 0,01% Triton X-100 in jede Vertiefung und dunkel lagern für mindestens 30 min. Zentrifuge bei 500 UpM für 1 Minute. Mit einem 12-Kanal-Pipette, absaugen Tiere aus dem Boden jeder Vertiefung mit 2 x 7 ul schnelleSchlaganfälle und auf eine 96-well-Teflon gedruckten Glasobjektträger verzichten. Vorsichtig, ohne Entfernen von Würmern, entfernen Sie 9,5 l PBS aus jedem Well der Folie. Wenn Ihr Glasträger nicht passen direkt in Ihr Mikroskop mount, muss eine benutzerdefinierte bearbeitetem Aluminium Diahalter verwendet, um Würmer zu montieren. Langsam senken Deckglas auf 96-Well-Folie. Dieser Schritt kann einige Übung, um Blasen zu vermeiden oder zu überqueren von Würmern in andere Vertiefungen. Sichere Ecken mit Klebkraft. Bild Folie in Hellfeld-und Fluoreszenz mit einer GFP / FITC-Filter auf einem automatisierten Mikroskop eingestellt. Die Lipid-Signal Lichtbleichmittel einfach so sollte es in einer systematischen Weise in alle Wells abgebildet werden, nicht manuell, wie Ausbleichen zu künstlichen Unterschiede zwischen Brunnen führen wird. Für weitere Einzelheiten über Analyse, siehe Repräsentative Ergebnisse und Diskussion. 9. Biochemische Lipid Bestimmung mittels Festphasenextraktion (SPE) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC / MS) <p class="Jove_content"> Zur Validierung Lipidspiegel Nilrot auf Fluoreszenz basieren, gefolgt von Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse (GC / MS) auf Fettsäure-Methylester (FAME) von Triacylglycerinen (TAG) und Phospholipiden (PL), abgeleitet durchgeführt werden Wurm Pellets. Steps mit organischen sollte unter einem Abzug durchgeführt werden. Es sollte darauf geachtet, dass Lipide unter Stickstoff von Licht bei längerer Lagerung oder Inkubationsschritte geschützt aufbewahrt werden, da sie sehr anfällig für Oxidation sind. Worm Pellets aus 2.500-5.000 synchrone Tiere werden als Eingabe verwendet, genau wie oben, außer dass die Tiere werden auf 10 cm RNAi-Platten gezüchtet vorbereitet. Waschen 2.500-5.000 Würmer von je 10 cm Platte mit 10 ml M9-Puffer in einem 15 ml konischen Polypropylen-Röhrchen. Pellet Würmern bei 500 xg für 1 Minute und waschen Pellet erneut mit 10 ml M9-Puffer. Pellet Tieren bei 500 x g. Absaugen lassen 250 ul Gesamtvolumen, und entweder einfrieren flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C unter Stickstoff for eine spätere Verarbeitung oder gehen Sie direkt. Der Wurm Pellet kann direkt übernommen werden, um 9,3 Schritt, wenn Triglycerid Masse an Phospholipid Masse 8,13,21 normalisiert werden. Wenn jedoch der Ermittler wünscht Normierung auf Proteingehalt oder DNA-Gehalt sollte die Schnecke Pellets auf der höchsten Intensität in einem Ultraschallbad für 10 min, 30 sec an, 30 Sekunden aus, bei 4 ° C beschallt werden Wenn Protein oder DNA Normalisierung gewünscht ist, entfernen Sie einen 5 ul Aliquot und bestimmen Gesamtproteinkonzentration mit einem Bradford-Reagenz oder ähnliche oder Gesamt-DNA-Gehalt nach Säulenaufreinigung mit einem UV-Spektrophotometer. Fügen Würmern bis 1,5 ml 02.01 Chloroform: Methanol in einem Gewinde Borosilikatglas Rohr. Alle Transfers von organischen Lösungsmitteln sollte mit Glaspipetten werden. Mit einem wiretrol 50 ul Pipette 25 nM Phospholipid-Standard in 50 ul und 16,7 nM Triglycerid-Standard in 50 ul. Beide Standards in 2:1 Chloroform sollte aufgelöst werden: Methanol, gedeckelt fest,und unter Stickstoff aus Licht in einem -80 ° C Gefrierschrank, um die Oxidation zu vermeiden geschützt wird. Cap mit phenolischen Kappe und Wirbel. Extrahieren für 1 h bei RT, Vortexen alle 15 min. Zentrifugieren bei 1000 UpM für 5 min. Übertragen untere organische Phase ohne Kadaver an einem Borosilikat Kultur Röhre. Fügen Sie 0,3 ml 0,9% NaCl, Wirbel und Zentrifuge bei 1.000 rpm für 5 min. Übertragen untere organische Schicht in ein frisches Borsilicat Kulturröhrchen, darf dabei nicht über einen der wässrigen Phase zu übertragen. Dry organische Phase unter Stickstoff. Zu Beginn Festphasenextraktion (SPE) resuspendieren getrockneten Lipids in 1 ml Chloroform. Alternativ für detaillierte Trennung und Analyse von klar strukturierten Lipid-Klassen, einschließlich Phospholipid Klassen, Glycolipide, Sphingolipide, Diacylglycerinen, Triglyceride, freie Fettsäuren und Cholesterin Ester, Dünnschichtchromatographie als Pionier des Watts Labor in C. elegans 22 kann in Ort der SPE verwendet werden. Lipide können auch be mittels HPLC und Fraktionen durch GCMS analysiert getrennt. Ausgefeilte Methoden der ganzen lipidome Profiling liquid-chromatography/MS (LCMS) kann auch 23-26 verwendet werden. Montieren Silica SPE Spalte SPE vielfältig. Pre-Abgleichschaltung Säule mit 3 ml Chloroform. Erlauben Lösungsmittels durch Schwerkraft fließen. Lipid geladen Probe auf SPE-Säule, das Sammeln Durchströmung in einem Gewindeabschnitt Borsilicat Röhre als Teil der ersten Fraktion (TAG Fraktion). Die meisten neutralen Lipide kommen durch in dieser ersten 1 ml Durchströmung. 3 ml Chloroform eluieren vollständig TAG Fraktion, Sammeln Durchströmung im TAG Fraktion Röhre. Entfernen und verschließen die erste Kollektion Rohr, und ersetzen Sie mit einem sauberen Sammelröhrchen. Eluieren Glykosphingolipide mit 5 ml 9.01 Aceton: Methanol. Wir haben nicht routinemäßig analysiert die Fettsäurezusammensetzung dieser Fraktion, jedoch kann es wichtige Informationen enthalten und können zur Herstellung von Methylestern und frei Sphingoidbasen zur weiteren Analyse unter Verwendung gespeichert werdenFachverfahren unterscheiden sich von denen für TAG und PL wie zuvor 27 beschrieben. Ersetzen Glykosphingolipid Sammelröhrchen mit einem zweiten Gewinde Borosilikat Sammelröhrchen. Eluieren Phospholipide mit 3 ml Methanol (PL-Fraktion). Fraktionen können bei -80 ° C an dieser Stelle begrenzt fest unter Stickstoff gelagert werden. Dry gereinigten Lipide unter Stickstoff. Dem Trocknen in einem trockenen Heizblock bei 33 beschleunigen ° C. Speichern niemals Lipide in getrockneter Form, wie sie besonders anfällig für Oxidation im getrockneten Zustand sind. Resuspendieren getrockneten Lipidfraktionen in 2 ml 2% H 2 SO 4 in Methanol durch Vortexen und inkubieren begrenzt dicht über Nacht in einem 55 ° C Wasserbad auf FAMEs erstellen. Es ist darauf zu absolut kein Wasser in der FAME Reaktion zu erhalten, da dies stark hemmen Derivatisierung von Lipiden werden. Wir haben effizientere Derivatisierung durch Inkubation über Nacht gefunden und die Literatur schlägt weniger Lipid Oxidation bei niedrigeren Temperaturen During FAME Vorbereitung 28. Eine alternative und schnellere Methode ist auf 2 ml 2,5% H 2 SO 4 in Methanol verwenden und derivatisieren für eine Stunde bei 70 oder 80 ° C 21,22,29. Am nächsten Morgen aus dem Bad zu entfernen und abkühlen lassen. 1,5 ml H 2 O (um die Reaktion zu stoppen) und dann 0,3 ml Hexan (die FAMEs Auszug) zu jedem TAG und PL Fraktion. Kräftig schütteln und zentrifugieren bei 1.000 rpm für 5 min. Sehr vorsichtig nur Top Hexanschicht mit einem Standard-Pipette oder Pasteurpipette. Dispense in Autosampler Röhre. Stellen Sie sicher, keine angesäuertem Methanol enthalten, da dies die GC-Säule und MSD zerstören. Cap und Last Proben auf GC / MS. Die Probe wird in Hexan zu einer Mikrospirale Agilent Phiole mit einem PTFE-Silikon-PTFE Schraubkappe verschlossen übertragen. Es ist dem Agilent GCMS Modell 6890/5973N mit einem Supelcowax-10 (24.079) 30 Meter, 250 Mikron Quarzglas-Kapillarsäule ausgestattet übertragen. Ein Mikroliter ist int injiziertoa Splitlos-Einlass gesetzt bei 250 ° C und 13,33 PSI Ultrapure Helium ein Trägergas verwendet wird. Das Protokoll Lauf ist wie folgt auf einem konstanten 1 ml pro min: Schritt Unterricht Ziel Temperatur 1 Halten Sie 2 min 150 ° C 2 Rampe 10 ° C pro min 200 ° C 3 Halten 4 min 200 ° C 4 Rampe 5 ° C pro Minute 240 ° C 5 Halten 3 min 240 ° C 6 Rampe 10 ° C pro min 270 ° C 7 5 min halten 270 ° C A 3 min Lösungsmittel Verzögerung bei der MSD verwendet werden, um Verschleiß an der fil minimierenament. Danach werden Massen zwischen 50 und 550 Dalton mit der MS vierfachen Menge bei 150 ° C und der Quelle ms bei 230 ° C gesetzt erkannt wird, mit einer thermischen Hilfs Temperatur von 270 ° C.

Representative Results

Ein Beispiel von einem abgebildeten Platte, die den Arbeitsablauf Fettfärbung entnommen wurde, ist in 1 gezeigt. Bestimmte Steuerelemente für hohe Fett (daf-2 Insulinrezeptor RNAi), wenig Fett (lpd-3-Protein für die Lipid-Speicher Granulate im Darm RNAi erforderlich), klein und wenig Fett (FASN-1 Fettsäure-Synthase RNAi) und leeren Vektor ( Kontrolle) zeigen die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität nach den Fettgehalt der Tiere und die entsprechenden Lipid Mengen mittels GC / MS-Analyse (Abbildung 2). Beachten Sie, dass Gen Inaktivierungen was zu entwicklungspolitisch verhaftet, kleine Tiere werden oft scheinen viel weniger Fett als erwachsene Kontrolltiere haben, unabhängig von einem Anschluss an den Fettstoffwechsel (Abbildung 3). Sekundäre Analysen, einschließlich Färbung Analyse und Lipidbiochemie mit SPE-GCMS von Wildtyp-Kontrolltieren einer ähnlichen Entwicklungsstufe muss getan werden, um die Gültigkeit zu gewährleistenkleine oder entwicklungspolitisch festgenommen positive Treffer. Im Falle der FASN-1 RNAi (Abbildung 2), Tiere Festnahme entweder in der L2 oder L3 Larvenstadium und haben Fettfärbung niedriger als erwachsene Kontrolle RNAi, aber ähnlich in Fülle L2-L3-Stadium Kontrolle RNAi Tieren (Fett Fleck Prozent der erwachsenen Kontrolle RNAi: 49,9 ± 4,5% für FASN-1 RNAi und 20,2 ± 2,1% für L2-Steuerung RNAi, und 64,7 ± 1,3 für L3-Steuerung RNAi). Alternativ angegeben biochemische Analyse eine niedrigere TAG / PL-Verhältnis als L2 Bühne abgestimmt N2 Kontrolltiere (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 für FASN-1 RNAi und 46,1 ± 3,4 für die Stufe-Kontrollgruppe RNAi, P ≤ 0,05). So in diesem Fall kann es durch biochemische Analyse bestätigt werden, dass FASN-1 eine Rolle in Lipidspeicherung nicht nur eine Bühne-spezifische Reduktion der Fettmasse hat. Die Follow-up-Analyse der abgebildeten Würmern stützt sich stark auf eine rechnerische Plattform wie Cell Profiler mitdie WormToolbox 30. Für kleinere Mengen von Bildern kann eine öffentlich verfügbare Bildanalyse Plattform wie ImageJ, frei verfügbar unter der NIH, verwendet werden. Für unsere Analyse wurden einzigartige Matlab Script erster die gut identifizieren und nachfolgend zu leeren Vertiefungen oder solche mit Blasen auszuschließen, und unterscheiden kleinen Schmutz aus Würmern verwendet. Manuelle Qualitätskontrolle notwendig war für Bilder Abseitsposition Ausgrenzung für den oben genannten Gründen. Wir fanden empirisch, dass der 90. Perzentile Intensität der Wurm Pixel über einen Brunnen, normiert auf Wurm-Bereich über eine gut, vorausgesetzt, konsistente Metrik Färbeintensität in allen Phasen des Wurms Entwicklung (Abbildung 3). Integration insgesamt Fettmasse über den Bereich der Schnecke, im Gegenteil, würde dazu neigen, kleine helle Würmer äquivalent punkten mit großen dim Würmer. Da unsere Methode nicht integrieren ist insgesamt Fluoreszenzsignal über den Bereich der Schnecke, in der Einnahme einer Intensität Perzentil, haben Änderungen in Wurm Größe per se keint Bias die Intensität gemessen. Stattdessen werden Unterschiede in der Pixelintensitätsverteilung gemessen. Doch trotz dieser, sind deutliche Unterschiede in der Färbung Pixelintensitätsverteilung zwischen Tieren unterschiedlicher Entwicklungsstadien zu sehen, so ist es wichtig, die Wirkung von RNAi auf ein beliebiges Gen gegen Tiere eines vergleichbaren Entwicklungsstadium (Abbildung 3) zu studieren. Durchschnittliche Variabilität zwischen repliziert wird in Abbildung 4 dargestellt was eine hohe Reproduzierbarkeit der Fettfärbung Methode. Beachten Sie, dass die Festigkeit des Verfahrens in hohem Maße von den Erhalt qualitativ hochwertige Bilder für jede Platte, unter einheitlichen Beleuchtungsbedingungen, unter Verwendung identischer Belichtungszeiten ist und mit minimaler Blasen, Schmutz oder Crossover von Würmern in andere Vertiefungen. SPE wurde am vorgemischten durchgeführt gereinigt Standards bis zu welchem ​​Grad TAGs von PLS (5A) getrennt werden konnten bestimmen. In dieser Analyse konnten wir eine 100% separation von TAG und PL, angegeben als eine vollständige Abwesenheit von 17.00 Fettsäuren aus PL im TAG Probe abgeleitet und eine entsprechende vollständige Abwesenheit von 13.00 Fettsäuren aus TAG im PL Probe (5A) abgeleitet. So SPE ist sehr effizient bei der Trennung von Lipid-Klassen. Diese Analyse zeigt nicht, dass alle TAGs unterschiedlicher Kettenlänge äquivalent durch SPE gereinigt werden erkannt und durch GCMS mit ähnlicher Effizienz. Es stellt sicher, dass nur TAG und PL Lipide werden insgesamt vollständig voneinander getrennt. Eine Probe GC-MS Spur von N2 Wildtyp Tieren durch Festphasenextraktion und FAME Vorbereitung genommen wird in 5B gezeigt. Sowohl für TAG und PL, kann Spitzen basierend auf Retentionszeit und Mutter-und Tochter-Ionen auf dem Massenspektrum und der Gesamtfläche unter den identifizierten Peaks normiert auf den Bereich der jeweiligen internen Standards identifiziert werden. Um die Menge der normierten TAG, die Fläche zu bestimmenunter allen Peaks des Chromatogramms TAG, mit Ausnahme des 13.00-Standard, wurden zusammengegeben und geteilt durch die Fläche unter dem Peak 13.00. Ebenso sind, um das normalisierte insgesamt PL Menge, die Fläche unter allen Peaks, mit Ausnahme des 17.00-Standard zu bestimmen, wurden addiert und geteilt durch die Fläche unter dem Peak 17.00. Die normalisierten Werte für die TAG und PL Proben werden dann verwendet, um den endgültigen TAG / PL-Verhältnis für die Probe zu berechnen: Es sollte beachtet werden, dass die Daten von SPE-GCMS eine viel komplexere Analyse von Fettsäuren, die in jeder Lipidfraktion als einfache Berechnung der gesamten TAG an PL-Verhältnis zu erlauben. Zum Beispiel kann der Prüfer integrieren einen einzigen Peak einer einzigen Fettsäure und Vergleichen seiner normierten Abundanz in Proben (zB comparing in N2 Wildtyp gegenüber daf-2 RNAi die integrierte Fläche des 18.00 peak vom 13.00 Standard-Peaks, normiert auf insgesamt PL Masse PL 17.00 Standard Peakfläche geteilt) unterteilt: Sollte der Prüfer wählen, wäre es auch möglich, den Prozentsatz an jedem gegebenen Fettsäure in der TAG oder PL Fraktionen als Prozentsatz der Gesamtmenge an Fettsäure bestimmen quantifiziert (als Beispiel 18.00 in der TAG-Fraktion in N2 Würmer ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt = "Abbildung 1" fo: content-width = "3.25in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Typischen Arbeitsablauf für das gesamte Experiment. Tag 1 werden gefrorene RNAi Bibliothek Platten auf Amp / Tet LB Agarplatten gestanzt und bei 37 ° C. Tag 2 werden Amp / Tet Platten auf Saatgut Flüssigkulturen von RNAi Klone in tiefen Well-Blocks verwendet wird. Tag 3 werden die Bakterien durch Zentrifugation konzentriert und in 96-Well-Platten RNAi. Tag 4, L1 hatchling C. elegans sind RNAi Platten in Flüssigkeit zugegeben und trocknen gelassen. Tag 7 werden die Tiere in flüssiger gesammelt, gefärbt mit Nilrot in 40% Isopropanol, montiert auf 96-Well-Teflon gleitet, und mit einem abzubildenden Hochdurchsatz-Mikroskop. Abbildung 2. Fixative-basierte Nile rote Flecken großen <em> C. elegans Fettdepots. Repräsentative Hellfeld und GFP-Fluoreszenz Bilder werden von N2 Würmer gefüttert FASN-1 (kleine, wenig Fett), lpd-3 (fettarme) gezeigt, Kontrolle (Leervektor) oder daf-2 (fettreichen) RNAi-Klone. Proben wurden gemäß dem Protokoll (schematisch in Abbildung 1) verarbeitet. Tiere fixiert, gefärbt in Nilrot und abgebildeten Ergebnis in vergleichbaren Lipidwerte ab biochemischen Lipid Messung erhalten. Isopropanol-fixierten Nilrot Fluoreszenz Ebenen, von mindestens 6 Wiederholungen biologischen erworben, sind in der ersten Zeile angezeigt. Quantitative Triglyceridspiegeln, reflektierenden der gesamten neutralen Lipid speichert, wenn die allgemeine Phospholipid Ebenen (TAG / PL), von 4 biologischen genommen normalisiert repliziert, werden in der zweiten Zeile angezeigt. Es ist wichtig zu beachten, dass die absolute Quantifizierung von Fixiermittelpartikel Nilrot Färbung und biochemische Bestimmung Lipid erreicht oft nicht perfekt. In diesem Fall, obwohl qualitativähnlich, FASN-1 (RNAi) mehr verschiedenen Triglycerid Masse vs Kontrolle durch biochemische Methoden als durch Mikroskopie angedeutet hat, ist vergleichsweise lpd-3 verschieden sind und daf-2 (RNAi) kleiner verschieden, obwohl alle Unterschiede sind statistisch hoch signifikant und Messungen waren gut reproduzierbar. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM (*, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,0001 relativ zu steuern, durch ungepaarte, zweiseitiger T-Test unter Annahme gleicher Varianz bestimmt). Abbildung 3. Fettmasse durch Fixierung Nilrot Färbung bei verschiedenen Larvenstadien bestimmt. Tiere wurden am OP50 Bakterien gezüchtet und wird an der L1, L2, L3, L4 und graviden erwachsenen Entwicklungsstadien. Die Bilder wurden nach Fixierung Färbung erfasst und analysiert mit Hilfe einer angepassten Matlab Skript, um die 90-Perzentil o bestimmenf Pixelintensität über den identifizierten Schnecke Bereich. Beachte, dass die Lipidspiegel von Tieren stark erhöhen, wenn das Tier entwickelt von L2 bis L4-Stadium, und dann leicht abnehmen, wenn das Tier beginnt, um Kalorien zu der Proliferation der Keimbahn im erwachsenen Stadium abzulenken. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM für 6-8 Wiederholungen (**, P ≤ 0,0001 gegenüber schwangeren Erwachsenen, von ungepaarten, zweiseitigen T-Test). Abbildung 4. Hohe Reproduzierbarkeit über unabhängige biologische Replikate. Dargestellt ist ein Streudiagramm Nilrot Fluoreszenzintensitäten über biologische Replikate (n = 6-8). Für jede Wiederholung, werden alle Werte auf die mittlere Intensität der Leervektor Kontrollen normalisiert. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM (**, P ≤ 0,0001 relativ zu steuern, durch ungepaarte, zweiseitiger T-Test bestimmt vorausgesetztgleiche Varianz). Abbildung 5. GC-MS-Chromatogramme von SPE-Standards und Wildtyp TAG und PL Abundanz getrennt. (A) GC-MS Spuren der SPE Trennung von TAG und PL Standards dargestellt. Beachten Sie die vollständige Abwesenheit von 13.00 Fettsäure in der PL Spur und die entsprechende Abwesenheit des 17.00 Fettsäure in der TAG-Spur, was eine vollständige Trennung der TAG (tritridecanoin) aus PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero -3-phospho-(1'-rac-glycerin)). (B) Ein Vertreter gesamte Spektrum der TAG und PL aus einer Stichprobe von N2 Wildtyp gefütterten Tieren Vektorregelung RNAi (HT115 Bakterien mit L4440 leeren Vektor RNAi). Ein Mikroliter-Probe wurde in einem Agilent 6890/5973N GCMS gemäß dem Protokoll injiziert und einzelne Peaks wurden identifiziert durch retention Zeit und ihren jeweiligen Massenspektren. Abkürzungen: Cyclo, Cyclopropan Fettsäure; iso:. Iso-methyl verzweigtkettigen Fettsäure; GLA, Gamma-Linolensäure; ALA, Alpha-Linolensäure, DGLA, Dihomo Gamma-Linolensäure, EPA, Eicosapentaensäure hier klicken größere Figur anzuzeigen .

Discussion

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine schnelle, groß angelegte Screening Blutfettwerte in C. elegans, die leicht zu hohen Durchsatz Bildschirme angepasst werden können. Im Gegensatz zu bisher verwendeten Methoden, die eine längere Fixierung Schritt in Paraformaldehyd von mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen 8,10 folgten einzubeziehen, bedarf unserer Protokoll eine einfache 3-min Fixierung in Isopropanol. Wir haben festgestellt, dass durch die Färbung C. elegans in 40% Isopropanol, werden sie frei durchlässig Nilrot, ohne die Verwendung von zusätzlichen Gefrier-Tau-oder Fixierung Schritte. Auch, wie Nilrot selektiv fluoresziert in hydrophoben Abteilen im grünen Spektrum 18,19,31, keine Entfärbung notwendig. Insgesamt können Tiere aus RNAi Platten gebeizt und bereit für Aufnahmen Tiere werden in etwas mehr als 2,5 Stunden genommen. Dieses Verfahren kann relativ kostengünstig und mit hoher Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Das Verfahren ist nicht auf die Fähigkeit von C. ab elegans, um die Aufnahme oder Konzentratder Farbstoff, und muss daher nicht die gleichen Einschränkungen wie Zuführen Methoden Verwendung von vitalen Farbstoffen. Angesichts Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Messungen ist das Verfahren geeignet für das Screening einer großen Anzahl von Gen Inaktivierungen durch RNAi. Wenn Quantifizierung der Blutfettwerte basierend auf Fixativ Nile rote Färbung gewünscht wird, empfehlen wir den Einsatz von 4-6 biologischen Replikate mit den entsprechenden Kontrollen und statistische Tests angewendet.

Es ist wahrscheinlich, dass viele Gene Inaktivierungen was zu kleinen Tieren (durch RNAi-Klone verursachen verzögert oder festgenommen Entwicklung) kommen würde, aus einem Bildschirm für Fett Regulatoren, unabhängig von einem Anschluss an den Fettstoffwechsel. Während der Bildanalyse Programm, das wir Konten für Würmer in verschiedenen Größen verwendet durch die Normalisierung der Fluoreszenzintensität dem Wurm Bereich können einzelne Forscher auch zu prüfen, den Vergleich der Fettfärbung Ebenen von kleinen Tieren zu Wildtyp Tieren einer ähnlichen Entwicklungsstufe. ImBei kleinen oder entwicklungsreguliert festgenommen Tiere mit scheinbar geringen Fettmasse, empfehlen wir, dass keine einzelne Modalität ausreichen, um veränderten Fettstoffwechsel demonstrieren. Mehrere Follow-up-Untersuchungen, einschließlich SPE-GCMS könnte erforderlich, um die Lipid-regulierende Funktion dieser Gene zu ermitteln. Für bekannte Stoffwechselregulator FASN-1, SPE-GCMS Analyse entwicklungspolitisch abgestimmt N2 L2 Kontrolltieren verglichen notwendig war, um die scheinbare fettarme Phänotyp gefunden, wenn die erwachsenen Kontrolltieren verglichen bestätigen. Während Nilrot Fettfärbung angegeben niedrigeren Fettgehalt im Vergleich zu erwachsenen RNAi, wenn auf Stufe abgestimmt L2 Kontrolle RNAi Tieren im Vergleich zu kontrollieren, wurde kein Unterschied gesehen. Dementsprechend eines zweiten Verfahrens verwenden, dh es wurde biochemischen Quantifizierung des TAG / PL-Verhältnis notwendig, um festzustellen, dass FASN-1 ein wahrer Regulator der Fettmasse ist, wie FASN-1 RNAi ist biochemisch unterscheidbare aus Stufe abgestimmten Steuerung L2 RNAi Tieren.

<p class = "jove_content"> Während wir Bildgebung und Verarbeitung für ein Hochdurchsatz-Plattform zu präsentieren, eine herkömmliche aufrechtes Mikroskop leicht verwendet werden, um Bilder von Würmern auf Agarose Pads 20 oder auf konventionellen bemessen Teflon bedruckten montiert einzufangen von 8 bis 12 gut Objektträgern . Die einzige Einschränkung ist, dass die grüne Fluoreszenz von Fetttröpfchen mit Nilrot Lichtbleichmittel gefärbt schnell, systematisch und einheitlich Expositionsbedingungen, die die Vergleichbarkeit zwischen den Bildern zu gewährleisten werden müssen. Wir finden, dass ein voll automatisiertes Mikroskop mit einheitlichen Bildaufnahme Bedingungen am besten zu diesem Zweck.

Eine der großen Stärken dieses Protokolls ist, dass nach Bilder gesammelt werden sie für künftige Re-Analyse gespeichert werden. Die gleichen Bilder verwendet werden, um die Körpergröße neben den Fettgehalt zu bestimmen. Außerdem ist, wie Rechenprogramme weiter fortgeschritten ist, lässt sich die Aussicht für einzelne Wurm Analyse, Erzeugung statistisch signifikante Ergebnisseaus einer Hand gut. So ist unsere Methode, die High-Throughput-Mikroskopie nutzt hat einige Vorteile gegenüber veröffentlichten Bildschirm Methoden, die eine Copas Biosort nutzen zu quantifizieren Fluoreszenzsignale 32,33. Allerdings sind die Methoden definitiv kostenlos.

Präzise, ​​biochemische Bestimmung des Fettgehaltes von SPE und GC / MS bestätigt die Nile rote Färbung der großen Fettreserven in C. elegans. Obwohl die absolute Quantifizierung von Fixativ Nile rote Färbung und biochemische Lipid Bestimmung erreicht oft nicht perfekt übereinstimmen, produzieren beide Methoden gut reproduzierbare und statistisch signifikante Ergebnisse, die qualitativ übereinstimmen. Darüber hinaus kann diese Methode auf die spezifischen Bedürfnisse der einzelnen Forscher, die weitere Analyse der einzelnen Klassen von Glykosphingolipiden, Phospholipiden oder Triglyceriden in verschiedenen Proben verlangen kann angepasst werden. Anzumerken ist, dass andere Gruppen haben anderen Technologie verwendet werden than SPE zu trennen Lipidklassen vor der GC / MS 22. Dünnschichtchromatographie (TLC) und Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) hat Vorteile gegenüber SPE gekennzeichnet, daß sie in der Lage sein besser separaten, verschiedenen neutralen Lipiden (z. B. TAG, Diacylglycerinen, freie Fettsäuren und Cholesterin-Ester) aus polaren Lipiden könnte (Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin) und Glykol-Sphingolipide. Wir wählen SPE, weil es ein Minimum von Ausgangsmaterial (2.500-5.000 Würmer) erfordert, betont er die wichtige langfristige Energiespeicher, TAGs, die den Großteil der neutralen Lipid-Fraktion 4 und ist schnell und erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Platten. Hervorzuheben ist, dass bei der Standard-Gemische, SPE vollständig trennt TAGs von PLS und ist hoch reproduzierbar und zuverlässig (siehe Abbildung 5A). Während Quantifizierung und Analyse von Fettsäuremethylestern erfordert eine GC / MS, ist diese Maschine allgemein verfügbar, und wenn nicht lokal ist, kann Probenwie oben erzeugt werden und bei -80 ° C unter Stickstoff bis zur Analyse durch einen Mitarbeiter oder kommerzielle GC / MS-Dienst eingerichtet ist.

Das GCMS Ausgabe enthält hochauflösende Daten auf jedem Fettsäure in jeder Lipidspezies. Dies erlaubt die Bestimmung der genauen Unterschiede zwischen den Proben verglichen. Als ein Beispiel könnte der Prüfer, ob die Konzentration bestimmter Fettsäuren im Überfluss wurden stärker als andere in daf-2, lpd-3-oder-1 FASN RNAi gegenüber Vektorregelung verändert. Diese enorm leistungsfähiges Werkzeug können daher detaillierte Informationen über die Lipidspezies in Hülle und Fülle mit einem experimentellen Manipulation verändert werden.

Für unsere Analyse haben wir am häufigsten zu normalisieren TAG Masse PL Masse. Während Protein-oder DNA auch verwendet werden könnten, um Lipid Masse nach der Bestimmung aus einem aliquoten beschallte Wurm Pellet zu normalisieren, so finden wir, dass diese Methoden unterliegen int werdenroduced menschliches Versagen bei allen Pipettierschritte und in der Probe Erholung von jeder Extraktion. Es ist aus diesem Grund, dass wählten wir stattdessen PL Masse wie unsere Normierungsfaktor. Unnatürlichen Standards zu Beginn des Protokolls (tritridecanoin für TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerin) zum PL) eingebracht werden durch alle Schritte der Festphasenextraktion durchgeführt und FAME Vorbereitung, und garantieren quantitative und repräsentative Erholung sowohl TAG und PL Fraktionen. Die gleiche Garantie kann nicht gemacht werden, wenn die Ermittler Protein oder DNA verwenden, um TAG Masse zu normalisieren. Wir glauben, PL, um die robuste Messgerät, mit dem TAG Ebenen in Proben zu vergleichen, da es wurde bereits gezeigt, dass PL nur minutiös wird durch den gleichen Reiz bewirkt große Masse Verschiebungen TAG Ebenen, z. B. erweiterte Hunger verändert oder erhöht Übung 34 – 36. PL werden gedacht, um eine strukturelle Rolle spielen, sicherzustellen Membranfluidität und zellulären integrity und Signalisierung Rollen statt als Energiespeicher 37-39. In unseren Händen, die TAG / PL-Verhältnis am ehesten, was mit Fixateur-basierte Lipid Färbung mit Nilrot erhalten, und stimmt mit dem von anderen Gruppen 21 gefunden. Eine alternative Strategie wird durch die Watts Labor, wo der Anteil der Lipid TAG gegenüber Gesamtlipide 9,22,29 berechnet wird.

Die Verwendung von nicht-native Arten von TAG und PL-Standard stellt sicher, dass keine nativen Fettsäuren in der Normalisierung Berechnung einbezogen werden. Die Wahl der Kettenlänge ist lediglich über die Notwendigkeit dieser Standards, um nicht mit den Massenspektren von nativen Fettsäuren stören basiert. Wir haben gefunden, dass Fettsäuren 13.00 und 17.00 am besten dazu dienen, diesen Zweck. Es ist möglich, da die unterschiedlichen chemischen Eigenschaften von kürzerkettigen Fettsäuren, dass unsere unnatürliche Fettsäurestandards möglicherweise nicht repräsentativ für die Wiederherstellung aller Kettenlänge Fettsäuren oder Ketten sein diffErent Sättigung Indizes. Somit ist es möglich, dass während SPE oder GCMS wir könnten Unterschiede in der Effizienz der Reinigung oder Detektion zwischen Lipiden unterschiedlicher Kettenlänge zu sehen. Basierend auf dieser und der unterschiedlichen Ionisierung der verschiedenen Fettsäuren in den GCMS, ist es nicht möglich, eine Aussage über die absolute Häufigkeit einer bestimmten Fettsäure machen. Deshalb haben wir nur zwischen Proben innerhalb einer einzigen Experiment Häufigkeiten von einem bestimmten Fettsäure vergleichen. Will man absolut quantifizieren eine Fettsäure, einer Weise gesucht dies erreicht wäre, eine Probe, hergestellt wie oben versetzt mit einer bekannten Menge eines stabilen isotopenmarkierten 13 C Version davon oder ähnlichen Fettsäure getestet werden, so dass es sein könnte unterscheiden basierend auf Masse des Stammion im MSD, zum Beispiel. Da wir nur Vergleichen relativer Mengen Lipidklassen oder beliebige Fettsäure, unserem 13.00 17.00 TAG und PL Standards dienen diesem Zweck angemessen, bei einem Minimum der Kosten, umgewährleisten eine angemessene und repräsentative Erholung der einzelnen Lipid-Klasse.

Bis zu diesem Zeitpunkt gab es einen Mangel an Konsens über die Auslegung bestimmter Ergebnisse durch verschiedene Methoden erhalten, und zu dem, was die vorherrschenden Methoden sein sollte. Insgesamt ist festzustellen, dass keine Methode isoliert bestens geeignet ist, den Fettstoffwechsel in C. studieren elegans. Jedoch durch die Verwendung mehrerer Screening und Validierung Modalitäten, kann man erreichen Vertrauen in Daten auf Lipid regulatorischen Genen erhalten. So wollen wir für unsere Protokoll als Maßstab für die künftige Arbeit im Bereich der C dienen elegans fat Forschung.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Michael Kacergis für technische Hilfe und Lianfeng Wu danken für Diskussionen und das Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Career Development Award vom NIH / NIDDK (K08DK087941 um AAS), einem NIH / NIDDK Ausbildungsförderung (5T32DK007028 zum ECP), die Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (AAS) und der Charles H unterstützt . Hood Foundation Child Health Research Award (AAS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
96-pin replicator Nunc 250520
LB Agar US Biologicals L1500
Agarose Invitrogen 16500500
Mechanical Pipettors Biohit M Line M10, M100, M300
Electronic Pipettor Biohit E Line E1200
1 M KH2PO4 Sigma P0662 pH 6.0 Sterilized by Autoclaving
1 M MgSO4 Sigma M2643 Sterilized by Autoclaving
1 M CaCl2 Sigma C2661 Sterilized by Autoclaving
NaCl Sigma S5886
5 mg/ml Cholesterol Sigma C8667 In 100% Ethanol
200 mg/ml Carbenicillin US Biologicals C1100 Filter Sterilized 0.2 μ
1 M IPTG US Biologicals I8500 Filter Sterilized 0.2 μ
100 mg/ml Ampicillin Filter Sterilized 0.2 μ
5 mg/ml Tetracycline In 100% Ethanol
Bacto Agar BD 214040
96-well TC Plates BD-Falcon 353072 For 96-well RNAi
Rectangular A/T Plates Thermo Scientific 242811 For stamping RNAi
LB Media US Biologicals L1530 Prepared as per manufacturer instructions
96-well Deep Well Assay Blocks Corning Costar 3960 Rectangular V-bottom assay block
96-well Shallow Well Assay Block Corning Costar 3956 Round V-bottom assay block
Sterile Sealing Film VWR 89134-432
Aluminum Sealing Film Corning Costar 6570 Thermowell Sealing tape for 96-well plates
M9 Buffer See Hope et al.20 See recipe below
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Nile red Invitrogen N-1142
Isopropanol Fisher BP2632-4
96-pin aspirator VP Scientific VP177A-1
96-well Teflon Masked Microscope Slides Thermo Scientific Custom Can also order Trevigen 96-well Cometslide
96-well Gold-Seal Coverslides Thermo Scientific Custom Can also use second 96-well Cometslide
Deep-well PCR plate VWR 89049-178
Non-sterile adhesive film VWR 60941-070
High-Throughput Microscope Leica DM6000 fully automated with Prior 96-well stage With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective
Bath Sonicator Diagenode Bioruptor XL
Chloroform Sigma 366927-4L
Methanol Fisher Optima F456-4
Phospholipid Standard Avanti Polar Lipids 830456P 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)
Triglyceride Standard NuChek Prep T-135 tritridecanoin
Wiretrol 50 μl Pipet Fisher 21-176-3A Drummond Scientfic
Acetone Sigma 320110-4L
Sulfuric Acid Fisher A300-500
Hexane Fisher Optima H306-1
SPE Silica Column Thermo Scientific 60108-317 Hypersep SI, 100 mg resin bed
Solid Phase Chromatography Manifold Sigma 57265 Supelco Visiprep 24-DL
Borosilicate Pipets Fisher 13-678-27F 10 ml size
Borosilicate Pasteur Pipets Fisher 13-678-8B
Borosilicate Culture Tubes Fisher 14-961-27
Threaded Borosilicate Tubes VWR 14235-460 8 ml capacity
Phenolic Caps for Culture Tubes Fisher 14-823-211
GC/MS Autosampler Vials Agilent 5188-6592
Caps for Autosampler Vials Agilent 5185-5861
GC/MS Agilent 6890 GC / 5973 MSD Outfitted with a Supelcowax-10 column

Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
NaCl 3 g
Agarose 17 g
Bacto peptone 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
1 M MgSO4 1 ml
5 mg/ml cholesterol 1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6.0) 25 ml
1 M CaCl2 1 ml
200 mg/ml carbenicillin 1 ml
1 M IPTG 5 ml
Dispense into 96-well RNAi plates. Store at 4 °C until use, up to 2 weeks.

Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
LB agar (US Biologicals) 32 g
2 M NaOH 1.5 ml
Bacto agar 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
Tetracycline 3 ml
100 mg/ml Ampicillin 0.5 ml
Dispense 45 ml into each plate. Store in dark at 4 °C until use, up to 4 weeks.

LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks

Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy.

100 mg/ml Ampicillin

Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Tetracycline

Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container.

200 mg/ml Carbenicillin

Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Cholesterol

Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months.

1 M MgSO4

Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M CaCl2

Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M KH2PO4, pH 6.0

Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches

Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature.

10 N NaOH

Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature.

1 M IPTG

Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation

Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use.

Nile red stock solution

Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner.

Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates

Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use.

Phospholipid Standard

Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

Triglyceride Standard

Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.
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References

  1. Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
  3. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
  4. Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
  5. Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
  6. Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
  7. Wang, M. C., O’Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
  8. O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
  9. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
  10. Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
  12. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
  13. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
  14. McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
  15. Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
  16. Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
  17. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
  18. Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
  19. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  20. Hope, I. L. . C. elegans: A Practical Approach. , 304 (1999).
  21. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
  23. Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
  24. Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
  25. Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
  26. Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
  27. Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
  28. Christie, W. W. . Advances in Lipid Methodology – Two. , 69-111 (1993).
  29. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  30. Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
  31. Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
  32. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
  33. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
  34. Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
  35. Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
  36. Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
  37. Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
  38. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  39. Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).

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Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).
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