הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em> Elegans Caenorhabditis</em
Summary
אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות ללימוד<em> Elegans Caenorhabditis</em> חנויות שומנים. הליך מהיר, פשוט, תיקון מכתים-הדמית אגל שומני ניאון ממנף את המאפיינים ספקטרליים של הצבע האדום lipophilic הנילוס. לאחר מכן אנו מציגים מדידה ביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפידים באמצעות מיצוי שלב מוצק וספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה המונית.
Abstract
נמטודות ג elegans התפתח כמודל חשוב ללימוד מסלולים הגנטיים המשתמרים ויסות חילוף חומרים של שומן שהיא מתייחסת להשמנה אנושית ופתולוגיות הקשורים אליו. כמה מתודולוגיות קודמות פתחו להדמיה של ג מאגרי שומן הטריגליצרידים עשירי elegans הוכיחו להיות מוטעה, הדגשת תאים סלולריים אחרים מאשר טיפי שומנים. שיטות אחרות דורשות ציוד מיוחד, הן זמן רב, או להניב תוצאות לא עקביות. אנחנו מציגים את שיטה מהירה, לשחזור, מקבע מבוססת הנילוס אדום מכתימה לאיתור המדויק ומהיר של טיפי שומנים ניטראליות בג elegans. צעד קיבוע קצר ב40% isopropanol עושה חיות לחלוטין חדירות הנילוס אדום, אשר לאחר מכן משמש לכתם בעלי חיים. תכונות ספקטרליות של צבע lipophilic זה לאפשר לו לזרוח חזק ובררני, בספקטרום צהוב הירוק רק כאשר בסביבת שומנים עשירה, אך לא יותרסביבות קוטב. לפיכך, טיפי שומנים ניתן דמיינו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד ביכולת הדמית GFP פשוט לאחר רק צעד קצר הנילוס אדום מכתים בisopropanol. מהירות, המחיר סביר, והשחזור של פרוטוקול זה להפוך אותו אידיאלי למסכי תפוקה גבוהות. אנחנו גם להדגים שיטה מותאמת לקביעה הביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפידים באמצעות גז כרומטוגרפיה המוני ספקטרומטריית. פרוטוקול קפדני יותר זה אמור לשמש כאישור לתוצאות המתקבלות מנחישות השומנים המיקרוסקופיות הנילוס האדום. אנו צופים כי הטכניקות הללו יהפכו לסטנדרטים חדשים בתחום ג מחקר מטבולי elegans.
Introduction
שימור של מסלולים מטבוליים בין בני אדם ואת elegans Caenorhabditis נמטודות הופך אותו אורגניזם מודל רב עצמה לחקר השמנה. בעוד ג elegans אין לי adipocytes הייעודי לאחסון שומן כמו ביונקים, שהם עושים חנות טריגליצרידים בטיפי שומני 1 ויש רבים מאותם רגולטורים של אחסון שומן ושימוש באנרגיה 2,3. לבדיקה לרמות שומן בג elegans, מספר שיטות הוצעו עם רמות שונות של נוחות והצלחה. השימוש פעם המשותפת של צבעי ניאון, חיוניים 4-7 נקרא לאחרונה לשאלה, וריאגנטים אלה הוכיחו שמכתימים תא נפרד ממחסן אחסון השומן העיקרי של ג elegans 1,8-11. צבעים מקבעים מבוססים שאינם ניאון, כגון סודאן השחורה ושמן האדום O, תוך הדגשה מוצלחת בטיפי שומנים בתולעת 12-14, אין להם כגדול טווח דינמי כדי לכמת כנורותסנאט צבעים 8,13,15. יתר על כן, שיטות נוכחיות של קיבעון לצבעי ניאון והן הלא ניאון הן זמן רבים וכרוכות בשלבים מרובים, הפשרה להקפיא ו / או שימוש בכימיקלים רעילים 1,9,10. השימוש באנלוגים שומנים BODIPY כותרת ספציפיים שדווח להדגשת טיפי שומנים כאשר מאכילים את התולעים חיים עם תיוג לטווח קצר 15. עם זאת, מסתמך על ספיגה של הצבע ולכן הוא מוטה על ידי ג טיפול elegans ומטבוליזם של חומצות שומן אנלוגים BODIPY. חלופה הוקמה על צבעי שומני צביעה היא תווית חינם פיזור, קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) או פיזור ראמאן מגורה (SRS) מיקרוסקופי, המנצל את תכונות הרטט האופייניות של מולקולות שומנים לדמיין מאגרי שומן 10,16, 17. עם זאת, ציוד מיוחד יקר הוא הכרחי לשיטה זו, והתפוקה נמוכה במקרה הטוב.
כדי למלא את הצורך בanaly מהיר, מדרגיםאחות של חנויות שומנים ניטראליות בג מחקר מטבולי elegans, אנחנו מציגים את רומן, שיטה לשעתק מאוד של שומנים בדם מכתים מקבע מבוסס הנילוס האדום. תכונות ספקטרליות וphysicochemical של הצבע האדום הנילוס lipophilic לגרום משמרת צהובה זהב רפאים בשיאו עירור של הפליטה, שמאפשרים לו לזרוח בספקטרום הפליטה הירוק רק כאשר בסביבת שומנים עשירה, אך לא בסביבות קוטב יותר 18 , 19. כך טיפי שומנים יכולות להתגלות לאחר צביעה פשוטה על ידי השימוש בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מסנן נקבע למיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההקלות והנגישות של טכניקה זו להפוך אותו אידיאלית למסכי תפוקה גבוהות. אנחנו גם להדגים שיטה לזווג, קפדנית לקביעה הביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפידים באמצעות מיצוי שלב מוצק וספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה המונית. מדידת שומנים ביוכימית בקורלציה עם נחישות מיקרוסקופית הנילוס האדום מבוסס של ג elegans faמסה לא, ואמורה לשמש כאישור לממצאים שנעשו בנחישות שומנים מיקרוסקופיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שהוצג מאפשר סינון מהיר, בקנה מידה גדול של רמות שומנים בג elegans, הניתן להתאמה בקלות למסכי תפוקה גבוהות. בניגוד לשיטות ששמשו בעבר, שכרוכים בצעד קיבעון ממושך בparaformaldehyde אחרי כמה מחזורי הקפאת הפשרת 8,10, הפרוטוקול שלנו דורש קיבוע 3-דקות פשוטים בisopropanol. אנחנו גילינו שעל ידי הכתמת ג elegans ב 40% isopropanol, הם הופכים באופן חופשי לחדיר הנילוס אדום, ללא שימוש באמצעים נוספים בהקפאה או הפשרת קיבעון. כמו כן, כנילוס אדום סלקטיבי מאיר במדורים הידרופובי בספקטרום הירוק 18,19,31, לא destaining הוא הכרחי. בסך הכל, בעלי חיים יכולים להילקח מצלחות RNAi לבעלי חי תמונה צבעוניות ומוכנים בקצת מעל 2.5 שעות. שיטה זו ניתן לבצע יחסית בזול ועם שחזור גבוה. השיטה לא תלויה ביכולתו של ג elegans לספיגה או להתרכזלצבוע, ולכן אין לו אותן המגבלות כמו האכלה באמצעות שיטות המבוססות על צבעים חיוניים. בהתחשב שחזור ודיוק של מדידות, השיטה מתאימה לסינון מספר גדול של הגנים inactivations ידי RNAi. אם לכמת את רמות שומנים בדם הוא רצוי על בסיס צביעה מקבעת הנילוס האדום, אנו ממליצים על השימוש ב4-6 ביולוגיים משכפל את הבקרות המתאימות והבדיקה סטטיסטית מיושמת.
סביר להניח כי רב inactivations הגן מוביל לבעלי חיים קטנים (עקב שיבוטי RNAi גורמים פיתוח מתעכב או נעצר) היה יוצא ממסך לרגולטורי שומן, ללא כל קשר לחילוף חומרים של שומן. בזמן שתכנית ניתוח התמונה שנוצלנו חשבונות לתולעים בגדלים שונים על ידי נרמול עוצמת הקרינה לאזור התולעת, חוקרים בודדים יכולים להיות גם שירצו לשקול השוואה בין רמות מכתים השומן של חיות קטנות לבעלי חיים מסוג פראי של שלב התפתחות דומה. ב מקרה של בעלי חיים קטנים או התפתחותית נעצרו עם מסת שומן נמוכה בעליל, אנו מציעים שלא שיטה אחת מספיקה כדי להדגים מטבוליזם שומנים שונים. מעקב ניסויים אחדים, כולל SPE-GCMS, עשויים להידרש כדי לברר את תפקוד שומנים ברגולציה של גנים אלה. לרגולטור טבולים ידועים fasn-1, ניתוח SPE-GCMS בהשוואה לבעלי החיים המתאימים התפתחותית N2 L2 בקרה הייתה צורך לאשר את הפנוטיפ השומן הנמוך בעליל מצא בהשוואה לחיות בקרה למבוגרות. בעוד כתמי שומן הנילוס האדום עולים רמות שומן נמוכות יחסית למבוגר לשלוט RNAi, בהשוואה לבעלי חיים בשלב מתאים-L2 בקרת RNAi, אין הבדל ניכר היה לראות. בהתאם לכך, שימוש בשיטה שנייה, כימות יוכימי כלומר יחס TAG / PL היה צורך לקבוע כי fasn-1 הוא רגולטור אמיתי של מסת שומן, כfasn-1 RNAi הוא יוכימית מובחנת מחי במה מתאימה-L2 בקרת RNAi.
<p cריבה = "jove_content"> למרות שאנו מציגים הדמיה ועיבוד לפלטפורמת תפוקה גבוהה, מיקרוסקופ זקוף קונבנציונלי יכול לשמש בקלות ללכוד תמונות מתולעים רכובים על agarose 20 רפידות או על גודל קונבנציונלי טפלון מודפס 8-12 שקופיות מיקרוסקופ גם . המגבלה היחידה היא שככל שפלואורסצנטי הירוקה של טיפי שומנים המוכתמים photobleaches הנילוס האדום במהירות, בתנאי חשיפה שיטתיים ואחידים צריכים להיות בשימוש על מנת להבטיח השוואה בין תמונות. אנו מוצאים כי מיקרוסקופ אוטומטי לחלוטין עם תנאי רכישת תמונה אחידים עובד הכי טוב להשפעה זו.אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול זה הוא שאחרי שהם אספו את התמונות ניתן לשמור לניתוח מחדש בעתיד. אותן תמונות יכולות לשמש כדי לקבוע את גודל גוף, בנוסף לתכולת שומן. יתר על כן, כתוכניות חישוביות מתקדמות יותר, יש סיכוי לניתוח תולעת אחת, שהניב תוצאות מובהקות סטטיסטימבאר אחת. לכן השיטה שלנו שמנצלת מיקרוסקופיה תפוקה גבוהה יש כמה יתרונות על פני שיטות שמשתמשות במסך שפורסם Copas Biosort לכמת אותות ניאון 32,33. עם זאת, מתודולוגיות בהחלט מחמיאות.
קביעה מדויקת, ביוכימי של תוכן שומנים על ידי SPE וGC / MS מאשרת המכתימה הנילוס האדום ממאגרי השומן הגדולים בג elegans. למרות quantitation המוחלט מושגת מהכתמה מקבעת הנילוס האדומים ונחישות שומנים ביוכימי לעתים קרובות אינו תואם באופן מושלם, בשתי השיטות לייצר תוצאות לשעתקו מאוד משמעותיות מבחינה סטטיסטית, שמסכימות איכותי. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לענות על צרכימים הספציפיים של חוקרים פרטיים שיחייבו ניתוח נוסף של המעמדות הנפרדות של glycosphingolipids, פוספוליפידים או טריגליצרידים בהווה בדגימות שונות. יש לציין שקבוצות אחרות השתמשו בטכנולוגיה tha האחרn SPE להפריד כיתות שומנים לפני GC / 22 MS. שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוהה (HPLC) יש יתרונות על פני SPE בכך שהם עשויים להיות מסוגלים שומנים טובים יותר נפרדים מובחנים ניטראליים (למשל, TAG diacylglycerols, חומצות שומן חופשיות, והאסטרים כולסטרול) משומנים קוטביים (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine) וגליקול-sphingolipids. אנחנו בוחרים SPE כי זה דורש מינימום של חומר מוצא (2,500-5,000 תולעים), היא מדגישה את חנויות הגדולות לטווח ארוך אנרגיה, תגיות, המרכיבות את רוב שומני השבריר הניטראלי 4, והוא מהיר, אין צורך ציוד מיוחד או צלחות. יודגש, שמבוסס על תערובות סטנדרטיות, SPE מפריד לחלוטין תגיות מפרספקטיבה, וניתן לשחזור ואמין ביותר (ראה 5 איור). אמנם לכמת וניתוח של אסטרים מתיל חומצת שומן דורשים GC / MS, ציוד זה זמין בדרך כלל, ואם לא באופן מקומי, דגימות רשאיותלהיות שנוצר כאמור לעיל ואוחסן ב -80 ° C עד הניתוח תחת חנקן ע"י משת"פ או מסחרי GC / MS שירות מסודר.
פלט GCMS מכיל נתונים ברזולוציה גבוהה על כל חומצת שומן בתוך כל מיני שומנים. זה מאפשר קביעת הבדלים מפורטים בין דגימות מושוות. כדוגמה, החוקר יכול לקבוע אם רמות חומצות שומן מסוימות שונו בשפע באופן משמעותי יותר מאחרים בdaf-2, lpd-3-1 או fasn RNAi לעומת בקרת וקטור. כלי עצום וחזק זה ולכן יכול לספק מידע מפורט על אילו מיני שומנים הם שינו בשפע בכל מניפולציה ניסויית.
לצורך הניתוח שלנו, אנחנו לרוב לנרמל המוניים TAG למסת PL. בעוד חלבון או DNA יכול לשמש גם כדי לנרמל את מסת שומנים בעקבות נחישות מaliquot של תולעת גלולת sonicated, אנו מוצאים כי שיטות אלה כפופים לintטעות אנושה roduced במהלך כל שלבי pipetting והתאוששות במדגם מכל מוצא. זה מסיבה זו עלינו בחרתי במקום להשתמש המונית PL כגורם הנורמליזציה שלנו. סטנדרטים טבעיים הציגו בתחילת הפרוטוקול (tritridecanoin לTAG, 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1'-RAC-גליצרול) לPL) מתבצעים דרך כל השלבים של מיצוי השלב המוצק ו הכנת תהילה, ולהבטיח התאוששות כמותית ונציג של שניהם שברים PL TAG ו. אותה הערבות לא יכולות להתבצע אם חוקרים להשתמש בחלבון או DNA כדי לנרמל המוני TAG. אנו מאמינים PL להיות מד החזק ביותר שבאמצעותו להשוות את רמות TAG פני דגימות, כפי שכבר הראה בעבר כי PL משתנה רק בדקדקנות על ידי אותו הגירוי ולחולל משמרות המוניות גדולות ברמות TAG, רעב ממושך למשל או פעילות גופנית מוגברת – 34 36. PL כנראה משחקי תפקיד מבני, הבטחת נזילות הממברנה והסלולרי integrity ותפקידי איתות, ולא כאמצעי לאחסון האנרגיה 37-39. בידות שלנו, יחס TAG / PL קרוב ביותר למה שמתקבל על ידי צביעת שומנים מקבעים מבוססת עם הנילוס אדום, ומסכים עם זה שנמצא על ידי קבוצות אחרות 21. אסטרטגיה חלופית משמשת וטס המעבדה, שבו אחוז TAG שומנים מחושב לעומת שומנים כלל 9,22,29.
השימוש בסוגים שאינם ילידים של TAG וPL הסטנדרטי מבטיח שלא חומצות שומן מקומיות תיכללנה בחישוב הנורמליזציה. הבחירה של אורך שרשרת מבוססת אך ורק על הצורך של תקנים אלו שלא להתערב בספקטרום ההמוני של חומצות שומן מקומיות. מצאנו כי חומצות שומן של 13:00 ו17:00 לשרת טובה ביותר למטרה זו. זה אפשרי, בהתחשב בתכונות הכימיות השונות של חומצות שומן קצרות שרשרת, שהסטנדרטים של חומצת השומן הטבעי שלנו לא יכולים להיות נציג של התאוששות של כל החומצות או שרשרות עם הבדל שומן שרשרת באורךמדדי רוויה erent. כך אפשר כי במהלך SPE או GCMS אנו עשויים לראות הבדלים ביעילות של טיהור או זיהוי בין שומנים באורכי שרשרת שונים. בהתבסס על זה והיינון השונה של חומצות שומן שונות בGCMS, אין זה אפשרי לעשות הצהרה מוחלטת על השפע של כל חומצת שומן נתון. לכן, אנו משווים רק בין דגימות בטווח של שכיחות ניסוי יחידה של כל חומצת שומן נתון. אם אחד לא רצה לכמת חומצת שומן לחלוטין, אופן זה יכול להיות מושגת תהיה לרוץ מדגם הוכן כאמור מתובל בכמות ידועה של גרסת יציבות כותרת isotopically 13 C של חומצת שומן או שדומה, כך שזה יכול להיות להבדיל מתבסס על מסה של יון ההורה בMSD, למשל. בהתחשב בכך שאנו משווים רק כמויות יחסיות של סוגי שומנים או כל חומצת שומן נתון, סטנדרטי PL 17:00 TAG ו13:00 לשרת מטרה זו במידה מספקת, במינימום עלות, ללהבטיח התאוששות נאותה ונציג של כל כיתת שומנים בדם.
עד לנקודה זו, חלה חוסר הקונצנזוס באשר לפרשנות של תוצאות מסוימות מתקבלת על ידי שיטות שונות, ומה המתודולוגיות הרווחות צריכות להיות. בסך הכל זה יש לציין כי אין שיטה אחת בבידוד הוא אידיאלי ללמוד חילוף חומרים של שומן בג elegans. עם זאת, באמצעות הקרנה מרובה ושיטות אימות, ניתן להשיג את האמון בנתונים המתקבלים על גני רגולצית שומנים. לפיכך, אנו מתכוונים לפרוטוקולנו לשרת כסמן לעבודה בעתיד בתחום ג מחקר השומן elegans.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לKacergis מיכאל לקבלת סיוע טכני וLianfeng וו לדיונים וקראתי את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס פיתוח קריירה מ-NIH / NIDDK (K08DK087941 לAAS), NIH / NIDDK אימוני מענק (5T32DK007028 לECP), ניו Scholar הקרן הרפואית אליסון פרס הזדקנות (לAAS) ובצ'ארלס H פרס. הוד קרן ילד בריאות מחקר (לAAS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
- Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
- Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
- Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
- Wang, M. C., O’Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
- O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
- Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
- Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
- Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
- Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
- McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
- Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Hope, I. L. . C. elegans: A Practical Approach. , 304 (1999).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
- Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
- Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
- Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
- Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
- Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
- Christie, W. W. . Advances in Lipid Methodology – Two. , 69-111 (1993).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
- Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
- Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
- Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
- Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
- Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).
