内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em

1。長方形アンプ/テト（A / T）LB寒天プレートおよびNGM IPTGのRNAiプレートの調製 / Tのプレートを4℃で使用するように1-4週間前に準備して暗所​​で保存して下さいメディアの1L用1Lの脱イオン水、32グラムのLB寒天、1.5ミリリットルの2M NaOH、および2gバクト寒天を追加します。液体のサイクルで40分オートクレーブ。 60℃に冷却した後、3 mlテトラサイクリンおよび0.5 mlのアンピシリンを追加します。各プレートに培地45mlを注ぎます。 事前に2週間までRNAiの96ウェルプレート3日の準備をします。 1Lの脱イオン水、3グラムのNaCl、17グラムアガロース、および2.5gのバクト：25、96ウェルプレートのRNAiを注ぐために、線虫の増殖培地（NGM）の1 Lを用意する。 121℃オートクレーブ液体サイクル℃の攪拌棒を備えた40分間。 60℃までホットプレートセットに攪拌、冷ます 1ミリリットルの1M MgSO 4を 、1mlの5 mg / mlのコレステロール、25 mlの1 M KH 2時60℃まで冷却し、以下の原液を追加</sub>のPO 4（pH6.0）で、1ミリリットルの1M CaCl 2を 、1ミリリットル200 mg / mlのカルベニシリン、および5 mlの1 M IPTG（レシピの材料表を参照）。 電子マルチチャンネルピペッターを用いて平底96ウェルプレートの各ウェルにRNAiのメディアを150μlを分注する。気泡を避けてください。調剤しながら60℃の水浴中に浸漬滅菌ステンレス製の容器にメディアを保管してください。 アガロースが固化するまでのRNAi板の高さを保ちます。プレートは、事前に2週間まで注ぎ、4℃で保存することができます 1日目 2。長方形アンプ/テト（A / T）をLB寒天プレートに冷凍ライブラリプレートをスタンプ暗闇の中でそれらを維持し、室温にA / Tプレートを温める。 -80からの振替96ウェルRNAiライブラリープレートは℃の氷を乾燥させる。ブンゼンバーナーの近くに密封されたアルミプレートを開きます。 H 2 Oを脱イオン、10％漂白剤で（10秒ずつ）シリアル端子を浸漬することにより、96ピンレプリケータを殺菌し、70％EToHは炎を通してピンを通すことによって続いた。 EtOHと炎のステップを繰り返します。 各ピンが接触し、各ウェルの表面を確認しながら、冷凍、96ウェルのRNAiグリセロールストックにレプリケータを適用します。 有害寒天表面ずに各ピンと小さな円を描いて、A / Tプレートにスタンプ。 -80〜再シールとリターンライブラリプレート℃、細菌の成長のために、37℃で一晩/ Tのプレートを刻印インキュベートする。 2日目 3。ディープウェルブロックで一晩RNAiの細菌クローンを育てる 37°CからA / Tのプレートを外して、細菌の増殖を確認します。 200μg/ mlのカルベニシリンを含むLB 1.5mlで96ウェルディープウェルブロックの各ウェルを埋める。 96ピンレプリケーター（ステップ2.3を参照）滅菌する。 必ずピンが各細菌のRNAiクローンと接触しながら、A / Tプレートの上部にレプリケータを適用します。ディープウェルブロックにレプリケータと浸すピンを持ち上げます。渦巻、ゆっくりと取り外し、CEを作る隣接した井戸を汚染しないrtain。 呼吸しやすいフィルムを使用してブロックを密封します。 37℃で一晩インキュベート℃で攪拌しながら（MT Infors Microtiteron IIの最寄りのシェーカー、または25ミリメートルスロー振盪インキュベーター中で250回転で950回転）。 3日目 4。 96ウェルNGMのRNAiプレートにシードRNAiの細菌クローン 4から96ウェルのRNAiプレートを取り外し℃、室温に戻した。 ディープウェルブロックを取り外し、4,000×gで10分間遠心する。 急速にメディアを排出するためにシンクにブロックを反転し、余分なメディアを排除するためにペーパータオルの上に反転したスタンプ。 層流フードの下では、無菌の膜と各ウェルシールに200μg/ mlのカルベニシリンを含むLBの40μlを添加する。 10分のペレットを再懸濁し、または手動で慎重なピペッティングでペレットを再懸濁するために細菌のシェーカー室温にブロックを返す。 層流フードで、深いから滅菌フィルムと転送細菌を除去96ウェルのRNAiプレートにウェルブロック。他のすべての行からの行の 'A'と 'H'、35μlに再懸濁した細菌の40μlを添加する。多くの液体はoverdryingとアガロースの割れを防止するために、96ウェルプレートのRNAiのエッジウェルに添加する。 乾燥度を定期的に検査し、4-6時間、フード内で乾燥させる発見プレートのままにしておきます。ドライバクテリアは曇り、明確ではありませんが表示されます。カバー、プレートを反転させ、室温で一晩インキュベートする。 5。ワームの同期人口を準備多くの妊娠ワームに満ち二つ10cmプレートは、6、96ウェルプレートのRNAiのための卵の準備のために使用されます。ワームは、少なくとも2世代（7日）のための非飢えていることを確認してください。 前述の20としてL1の同期人口を準備します。漂白剤溶液20mlについては、1ミリリットルのNaOH（10 M）を、5 mlのH 2 Oを脱イオン水、及び10ml M9バッファを4 mlの漂白剤を使用しています。 滅菌15mlに10ミリリットルM9で一晩ワームを同期する20℃回転にポリプロピレンチューブ℃の 4日目 6。 RNAiのプレートにワームを追加 1分間3000 xgで卵プレップを遠心分離します。 L1の孵化のペレットから離れて滞在し、上清を吸引します。 0.0005パーセントTriton X-100で5ミリリットルM9バッファーに再懸濁する。洗剤を少量の添加がピペットに付着する虫を防ぎ、脂肪染色には影響を与えません。 顕微鏡下でワームを数える。必要に応じて、マイクロリットル当たり10から15ワームに濃度を調整します。 層流フードでは、播種するために、各96ウェルプレートのため、浅いウェルアッセイブロックの1行の各ウェルに再懸濁させたワームの75μlを添加する。手動マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルのRNAiプレートの各ウェルに5μl中50から75のワームを追加します。 プレートは30から60分間、フード内で乾燥することができます。乾燥すると、顕微鏡下で、ワームがスラッシングしない、這うように見えるはずです。 RNAiのプレート上にワームを育てる20℃〜64時間加熱する。 7日目 7。ナイルレッドでワームを修正し、染色インキュベーターからRNAiのプレートを取り外します。これらの条件は脂肪量に影響を与えるとして、さらなる分析から除外する顕微鏡とレコード飢えやスラッシング（ウェット）の井戸の下で調べます。 電子リピートピペッターを用いて、RNAiのプレートの各ウェルにトリトンX-100 0.01％で150μlのPBSを追加します。 96ディープウェルPCRプレート内の対応する行にワームを使って手動マルチチャンネルピペッター、ミックス、移送液と。寒天を中断することは避けてください。ウェル当たり300μlのPBS中のワームの合計に対して、この手順を繰り返します。 4つのプレートが転送されたとき、1分間500rpmでプレートを遠心分離します。 井戸の底に〜25μlの液体やワームペレットを残して、96ピンの真空吸引器を使用して上清を吸引します。 動物を修正するための各ウェルにイソプロパノール40％の150μlを添加する。ワームを混ぜて十分に高い速度にピペッターであることを確認しイソプロパノール40％ペレット。 3分間室温でインキュベートする。 1分間500rpmで明らかにプレートを遠心分離します。 井戸の底にわずか25μlの40パーセントイソプロパノール+ワームペレットを残して、96ピンアスピレーターまたは手動を使用して、上清を吸引します。 イソプロパノール40％の1ミリリットルあたりのアセトン中に0.5 mg / mlの6μlのナイルレッド原液：各ウェルに、使用直前に調製ナイルレッド染色液150μlを添加する。 シール非滅菌接着フィルム付きプレートと、少なくとも2時間、暗所で染色。 8。ハイスループットMicroscopeの洗浄とイメージヴォルムス 1分間500rpmで遠心し、ナイルレッド染料のすべてが、25μLを吸引します。 少なくとも30分間、暗闇の中で各ウェルストアにトリトンX-100で0.01％のPBS 150μlを添加する。 1分間500rpmで遠心分離します。 、2×クイック7μlの各ウェルの底部から吸引動物を12チャンネルピペッターを使用してストロークと96ウェルテフロンプリントスライドガラス上に分注する。慎重に、ワームを除去することなく、スライドの各ウェルからのPBS 9.5μlを削除します。あなたのスライドガラスを顕微鏡のマウントに直接合わない場合は、カスタムのアルミ削り出しのスライドホルダーは、ワームをマウントするために使用する必要があります。 96ウェルスライド上にゆっくりと下カバーのスライド。このステップでは、バブルを回避したり、他のウェルにワームのクロスオーバーするいくつかの練習を取ることができる。接着剤タックを使った安全なコーナー。 自動顕微鏡でGFP / FITCフィルターセットを持つ明視野と蛍光の画像スライド。退色するとウェル間の人工の違いにつながるような脂質信号光退色は簡単ので、手動ではない、すべてのウェルにおける体系的な方法で画像化されるべきである。分析の詳細については、代表的な結果と考察を参照してください。 9。固相抽出（SPE）とガスクロマトグラフィー – 質量分析（GC / MS）を用いた生化学脂質決定<p class="jove_contentが">ナイルレッド蛍光に基づく脂質レベルの検証では、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC / MS）に続いては、トリアシルグリセロール（TAG）とリン脂質（PL）から由来脂肪酸メチルエステル（FAME）で実行することができワームペレット。有機物を含む手順はヒュームフードの下で行われるべきである。ケアは、それらが酸化に対して非常に脆弱であるとして、脂質は、拡張ストレージまたはインキュベーション工程中に光から保護し、窒素下で保たれるように注意してください。 2,500〜5,000同期動物からワームペレットはその動物を10cm RNAiのプレート上に成長させる以外は、上記とまったく準備し、入力として使用されます。 15 mlコニカルポリプロピレンチューブに10ミリリットルのM9バッファーで各10cmプレートから2,500〜5,000ワームを洗う。ペレット1分間500 xgでワーム、および10mlのM9バッファで再度ペレットを洗浄する。 500×gでペレット動物。窒素foの下で-80℃で液体窒素や店舗に250μlの総体積、どちら凍結°Cから吸引するrは後で処理または直接進んでください。 ワームペレットはトリグリセリドの質量はリン脂質の質量8,13,21に正規化する場合は9.3を直接ステップとることがあります。しかし、研究者はタンパク質含量やDNA含量に対して正規化を望んでいるなら、ワームペレットを10分間超音波処理浴中で最高の強度で超音波処理されるべきであり、30秒オン、30秒オフ、4℃タンパク質やDNA正規化が望まれているなら、5μlのアリコートを除去し、UV分光光度計を用いて、カラム精製後、Bradford試薬または類似または総DNA含量を用いて総タンパク質濃度を決定する。 スレッドホウケイ酸ガラス管中のメタノール：1.5ミリリットル2時01クロロホルムにワームを追加します。有機溶剤のすべての転送は、ガラスピペットを用いて行われるべきである。 wiretrol50μlのピペットを使用して、50μlの25 nMのリン脂質標準、および50μlの16.7 nMのトリグリセリドの規格を追加します。メタノール、しっかり蓋をし、：両方の規格を2:1のクロロホルムに溶解されるべきであると酸化を避けるために-80℃の冷凍庫で光​​から保護し、窒素下で保存されます。 フェノールキャップと渦の付いたキャップ。 15分毎にボルテックスし、室温で1時間抽出する。 5分間1,000 rpmで遠心分離します。ホウケイ酸培養管に死体なし低い有機相を転送します。 0.3ミリリットルの0.9％NaCl、5分間1,000 rpmでボルテックス、遠心を追加します。 水相のいずれかの上に転送しないように確認しながら、新鮮なホウケイ酸培養チューブに下部の有機層を転送します。 窒素下で乾燥した有機相。開始するには固相抽出（SPE）は、1ミリリットルのクロロホルムに乾燥した脂質を再懸濁する。代わりに、リン脂質クラス、糖脂質、スフィンゴ脂質、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、遊離脂肪酸、コレステロールエステルを含む別個の脂質クラスの詳細な分離·分析、薄層クロマトグラフィー用としてCでワットラボによって開拓22 エレガンス は、SPEの代わりに使用することができる。脂質はまた、Bかもしれないeは、GCMSにより分析HPLCおよび分数で区切られています。 liquid-chromatography/MSによって全体lipidomeプロファイリング（LCMS）の洗練された方法も、23から26を使用することができます。 SPEマニホールド上のシリカSPEカラムを組み立てます。 3 mlのクロロホルムを伴うプレカラム平衡化。重力によって流れるように溶剤を許可します。 最初のフラクション（TAG画分）の一環として、スレッドホウケイ酸チューブにフロースルー収集、SPEカラム上に脂質サンプルをロードします。ほとんど中性脂質は、この最初の1ミリリットルフロースルーに通ってくるでしょう。 TAG画チューブにフロースルーを回収し、完全にTAG画分を溶出させるために、3 mlのクロロホルムを追加します。 取り外して、最初のコレクションチューブにキャップをし、クリーンなコレ​​クションチューブに交換してください。メタノール9:1アセトン5mlでスフィンゴ糖脂質を溶出する。我々は日常的にこの画分の脂肪酸組成を分析しない、しかし、それは貴重な情報が含まれている可能性と活用、さらなる分析のためのメチルエステルと遊離スフィンゴイド塩基の調製のために保存することができ前述の27のように、タグとPLのものとは異なる特別な手順。 第二のねじホウケイコレクションチューブとスフィンゴ糖脂質コレクションチューブを交換してください。 3mlのメタノール（PL画分）とリン脂質を溶出する。 画分を、-80℃で窒素下に固くキャップこの時点で保存することができます。窒素下で脂質を精製し乾燥させてください。 33℃のドライヒートブロックで、乾燥速度℃に彼らは乾燥した状態での酸化に特に敏感であるため、乾燥形態で脂質を格納することはありません。 ボルテックスでのメタノール2 mLの2％H 2 SO 4に再懸濁し、乾燥脂質画分とインキュベートはのFAMEを作成するために55℃の水浴中で一晩しっかり締めくくった。ケアは、これは非常に脂質の誘導体化を阻害するとしてFAMEの反応に全く水が入らないように注意しなければなりません。我々は、一晩インキュベートすることにより、より効率的な誘導体化を発見したと文献が示唆するより少ない脂質酸化はより低い温度で発生ドゥーリngのFAMEの準備28。代替のより迅速な方法は、メタノール中で2ミリリットル2.5パーセントのH 2 SO 4を使用し、70〜80℃で21,22,29で1時間誘導体化することです。 翌朝、浴から除去し、冷まします。各タグとPL画分に、1.5 mlのH 2 O（反応をクエンチするため）と0.3mlのヘキサン（のFAMEを抽出する）を追加します。激しく振り混ぜ、5分間1,000 rpmで遠心分離します。 非常に慎重に標準ピペットやパスツールピペットを用いて、トップヘキサン層を削除します。オートサンプラチューブに分注します。これはGCカラムとMSDが破壊され、任意の酸性メタノールを含めないことを確認してください。 GC / MSの上にキャップをして、負荷のサンプル。サンプルは、PTFE – シリコーン、PTFEスクリューキャップで蓋をし、マイクロインサートAgilentのバイアルにヘキサンで転送されます。それはSupelcowax-10（24079）30メートル、250ミクロンの溶融シリカキャピラリーカラムを装備アジレントGCMSモデル6890/5973Nに転送されます。 1マイクロリットルはintに注入されるOAレス注入口は、250℃で13.33とPSIの超高純度ヘリウムをキャリアガスを使用されている設定。プロトコルの実行は、毎分1ミリリットル定数で次のとおりです。 手順 命令 目標温度 1 2分間保持 150℃ 2 ランプ10℃毎分 200℃ 3 4分間保持 200℃ 4 ランプ5℃毎分 240℃ 5 3分間保持 240℃ 6 ランプ10℃毎分 270℃ 7 5分間保持 270℃ 3分の溶媒遅延はFILの摩耗を最小限に抑えるために、MSDで使用されている知的障害者。その後、50〜550ダルトンとの間の質量は270の熱補助℃の温度で、150℃、230℃に設定したミリ秒のソースでMS四重セットで検出された