JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Биохимические и высокая пропускная способность Микроскопическая оценка жировой массы в<em> Caenorhabditis Элеганс</em

Published: March 30, 2013
doi:
10.3791/50180
, , ,
1Center for Human Genetic Research and Department of Medicine,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Earth, Atmospheric, and Planetary Sciences,Massachusetts Institute of Technology

Summary

Мы представляем надежные биохимические и микроскопические методы исследования<em> Caenorhabditis Элеганс</em> Липидов магазинах. Быстрое, простое, фиксируя-окрашивание процедура флуоресцентных изображений капли липидов использует спектральные свойства липофильных красителей Нила красного цвета. Затем мы представим биохимические измерения триглицеридов и фосфолипидов методом твердофазной экстракции и газовой хроматографии-масс-спектрометрии.

Abstract

Нематоды C. Элеганс стала важной моделью для изучения генетической консервативных путей регулирующего жировой обмен, как он относится к человеческой ожирения и связанных с ним патологий. Несколько предыдущих методиках, разработанных для визуализации C. Элеганс богатых триглицеридами жировые запасы оказались ошибочными, подчеркнув сотовой отсеков, помимо липидных капель. Другие методы требуют специального оборудования, отнимают много времени, или дают противоречивые результаты. Введем быстро, воспроизводимые, фиксатор на основе Нила красное окрашивание методом точного и быстрого обнаружения нейтральных липидных капель в C. Элеганс. Короткий шаг фиксации в 40% изопропанола делает животных полностью проницаемой для Нила красный, который затем используется для окраски животных. Спектральные свойства этого липофильных красителей позволяет ему сильно и избирательно флуоресцирует в желто-зеленом спектре только тогда, когда в липидной среде, богатой, но не болееполярной среде. Таким образом, липидные капли могут быть визуализированы на флуоресцентный микроскоп оснащен простым возможности визуализации GFP только после краткого Нила красное окрашивание шаг в изопропанол. Скорость, доступность и воспроизводимость этого протокола делает его идеально подходит для экранов с высоким пропускную способность. Мы также продемонстрировать парный метод биохимического определения триглицеридов и фосфолипидов методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Это более строгий протокол должен быть использован в качестве подтверждения результатов, полученных от Нила красные микроскопические определения липидов. Мы ожидаем, что эти методы станут новые стандарты в области C. Элеганс метаболические исследования.

Introduction

Сохранение метаболических путей между людьми и нематоды Caenorhabditis Элеганс делает его мощным организмом модель для изучения ожирения. Хотя C. Элеганс не адипоцитов посвященный жира, как у млекопитающих, они делают магазине триглицеридов в липидных капель 1 и обладают многими из тех же регуляторы жира хранения и использования энергии 2,3. Для анализа для жира в C. Элеганс, несколько методов были предложены с различными уровнями легкости и успеха. Некогда распространенное использование флуоресцентных, витальных красителей 4-7 недавно была под вопросом, и эти реагенты оказалась окрашивания отсека отличие от основного жировых депо хранения C. Элеганс 1,8-11. Фиксатор на основе не-флуоресцентных красителей, таких как Судан черный и масло-красно-O, в то время как успешные на освещение липидных капель в 12-14 червь, не имеют, как большой динамический диапазон для количественного как флуоресценциипроцентов красителей 8,13,15. Кроме того, современные методы фиксации и для флуоресцентных и не флуоресцентных красителей отнимает много времени и включать несколько замораживания-оттаивания шаги и / или использования токсичных химических веществ 1,9,10. Использование конкретных BODIPY-меченных аналогов липида, как сообщается, выделите липидных капель при скармливании живых червей с краткосрочными маркировка 15. Однако это зависит от поглощения красителя и, следовательно, предвзятые C. Элеганс обработки и обмена BODIPY жирные кислоты аналогов. Создана альтернатива липидов окрашивания красителями без наклеек, когерентного антистоксова рассеяния света (КАРС) или вынужденного комбинационного рассеяния (ВКР) микроскопии, которые используют характерные колебательные свойства молекул липидов для визуализации запасы жира 10,16, 17. Тем не менее, дорогие специализированное оборудование необходимо для этого метода, и пропускная способность низка в лучшем случае.

Для выполнения необходимо для быстрой, масштабируемой анализуSIS нейтральных липидов в магазинах C. Элеганс метаболические исследования, мы вводим новую, высокую воспроизводимость метода фиксатором на основе Нила окрашивания липидов красного цвета. Спектральные и физико-химические свойства липофильных краситель красного Нила вызывает желто-золотой спектральный сдвиг в его возбуждения пик излучения, что позволяет ей светиться в зеленом спектре излучения только тогда, когда в богатых липидами среде, но не в более полярных средах 18 , 19. Таким образом, липидные капли могут быть обнаружены после простого окрашивания с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) набор фильтров для флуоресцентной микроскопии. Простота и доступность этого метода делают его идеально подходит для экранов с высоким пропускную способность. Мы также показывают парные, строгий метод для биохимического определения триглицеридов и фосфолипидов методом твердофазной экстракции и газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Биохимические измерения липидов коррелирует с Нилом красные основе микроскопического определения C. Элеганс фат масса, и должна быть использована в качестве подтверждения выводы, сделанные с микроскопической определения липидов.

Protocol

1. Подготовка Прямоугольные Amp / Tet (A / T) Плиты LB агар и NGM IPTG RNAi Плиты A / T пластины должны быть готовы через 1-4 недели до использования и хранить в темном месте при температуре 4 ° C. Для 1 л среды добавляют 1 л деионизированной воды, 32 г агара LB, 1,5 мл 2 М NaOH и 2 г Bacto агар. Автоклаве 40 мин на жидком цикла. После охлаждения до 60 ° C, добавляют 3 мл тетрациклина и 0,5 мл ампициллина. Налейте 45 мл среды в каждую тарелку. Подготовка 96-а RNAi пластин 3 дней до 2 недель. Залить 25 96-и РНК-интерференции плиты, приготовить 1 л питательной среды нематоды (НГО): 1 л деионизированной воды, 3 г NaCl, 17 г агарозы, и 2,5 г bactopeptone. Автоклав жидкость цикл при 121 ° С в течение 40 мин с мешалкой. Дайте остыть, помешивая на горячую плиту установки до 60 ° C. Когда остынет до 60 ° С, добавьте следующие растворы: 1 мл 1 М MgSO 4, 1 мл 5 мг / мл холестерина, 25 мл 1 М KH 2 </suB> PO 4 (рН 6,0), 1 мл 1 М CaCl 2, 1 мл 200 мг / мл карбенициллин, и 5 мл 1 М IPTG (см. таблицу Материалы для рецептов). Внесите 150 мкл РНК-интерференции средств массовой информации в каждую лунку с плоским дном 96-луночный планшет с помощью электронного дозатора многоканальный. Избегайте пузырьков воздуха. Храните носители в стерильный сосуд из нержавеющей стали погружают в 60 ° С водяной бане при выдачи. Держите RNAi пластин уровне до агарозном затвердевает. Плиты можно налить до 2 недель заранее и хранить при 4 ° C. День 1 2. Штамп Замороженные Пластины библиотеки на прямоугольные Amp / Tet (A / T) Плиты LB агар Теплый A / T пластин до комнатной температуры, сохраняя их в темноте. Трансфер 96-а RNAi библиотеки пластин от -80 ° С до сухого льда. Откройте алюминиевых пластин запечатанных вблизи газовой горелки. Стерилизовать 96-контактный репликатора путем погружения контакты серийно (10 секунд каждый) в 10% отбеливателя, деионизованной H 2 O, а 70% EToh затем переходя контакты через пламя. Повторите EtOH и пламя шаг. Применить репликатор для замороженного 96-фонда скважин глицерина RNAi, убедившись, что каждый палец контактирует с поверхностью каждой лунке. Печать на A / T пластины, используя небольшой круг с каждого контакта без повреждения поверхности агара. Re уплотнения и возвращение библиотеки пластин до -80 ° C. Инкубируйте штамп A / T пластин при 37 ° С в течение ночи для роста бактерий. День 2 3. Расти RNAi бактериальных клонов Ночевка в глубоких и блоков Удалить A / T пластин от 37 ° C и подтвердить роста бактерий. Заполните каждую лунку 96-луночных глубоких скважин блок с 1,5 мл LB с 200 мкг / мл карбенициллин. Стерилизовать 96-контактный репликатор (см. п. 2.3). Применить репликатора к началу A / T пластины, убедившись, что контакты в контакт друг с бактериальной РНК-интерференции клон. Поднимите репликатор и погрузиться штифты в глубоких скважин блока. Swirl, и медленно удалить, делая сеrtain, чтобы не загрязнить соседние скважины. Печать блока с дышать легко фильма. Выдержите в течение ночи при 37 ° C при перемешивании (950 оборотов в минуту MT Инфорс Microtiteron II шейкер, предпочтительный, или 250 оборотов в минуту в 25 мм бросить инкубатор). День 3 4. Семенной RNAi бактериальных клонов на 96-луночных NGM пластин RNAi Удалите 96-а RNAi плит от 4 ° C и прогреть до комнатной температуры. Удалить глубинных блоков и центрифугируют 10 мин при 4000 х г. Быстро инвертировать блоков в раковину для слива СМИ и печать инвертируется на бумажное полотенце для удаления избытка средств массовой информации. Под капотом ламинарного потока, добавить 40 мкл LB с 200 мкг / мл карбенициллин в каждую лунку и печать с стерильной пленкой. Вернуться блоков до комнатной температуры бактериальной шейкере в течение 10 мин для ресуспендирования гранулы, или вручную ресуспендируют окатышей осторожным пипетированием. В ламинаре, удалить стерильной пленку и передачи бактерий из глубокойа блоки на 96-луночных RNAi. Добавить 40 мкл ресуспендированных бактерий строки 'A' и 'H', и 35 мкл от всех других строк. Более жидкость добавляется к краю лунки 96-луночных RNAi пластины для предотвращения пересыхания и растрескивания агарозы. Оставьте плит обнаружили высохнуть на капот на 4-6 часа, осматривая регулярно сухости. Сухие бактерии появляются ясно, не дождь. Крышка, инвертировать пластины и инкубировать при комнатной температуре в течение ночи. 5. Подготовка синхронного населения черви Два 10 см пластины наполнены многие беременные черви используются для подготовки яйцо на каждые 6 96-луночные RNAi. Будьте уверены, черви, не голодали в течение по крайней мере двух поколений (7 дней). Подготовка синхронного населения L1, как описано выше 20. Для 20 мл раствором хлорной извести, используйте отбеливатель 4 мл, 1 мл NaOH (10 м), 5 мл деионизованной H 2 O и 10 мл M9 буфера. Синхронизация червей на ночь в 10 мл M9 в 15 мл стерильнойполипропиленовые трубы с поворотом на 20 ° C. День 4 6. Добавить червей RNAi Плиты Центрифуга яйцо подготавливает при 3000 х г в течение 1 мин. Супернатант, держаться подальше от гранул L1 птенцов. Ресуспендируют в 5 мл буфера M9 с 0,0005% Triton X-100. Добавление небольшого количества моющего средства предотвращает червей от прилипания к пипетку и не оказывает никакого влияния на жировые пятна. Граф червей под микроскопом. Если необходимо, отрегулируйте концентрацию до 10-15 червей на микролитр. В ламинаре, для каждого 96-луночный планшет будет посеян, добавить 75 мкл ресуспендированных червей в каждую лунку из одного ряда мелких и анализа блока. Использование ручной пипетки многоканальных, добавить 50-75 червей в 5 мкл в каждую лунку 96-луночных RNAi. Разрешить пластин для просушки на капоте от 30 до 60 мин. При сухой, под микроскопом, черви должны, как представляется, ползком, не бьется. Расти червей на пластинах RNAiпри 20 ° С в течение ~ 64 часов. День 7 7. Исправить и красителей Черви в Ниле Красный Удалить RNAi пластины из инкубатора. Изучить под микроскопом и записи голода или обмолота (мокрый) скважин, чтобы исключить из дальнейшего анализа, так как эти условия влияют на жировой массы. Использование электронных дозаторов повторяю, добавить 150 мкл PBS с 0,01% тритона Х-100 в каждую лунку пластины RNAi. С ручной многоканальные пипетки, перемешать и передачи жидкости с червями в соответствующую строку в 96-глубокая-луночный планшет ПЦР. Избегайте нарушая агар. Повторить в общей сложности 300 мкл червей в PBS на лунку. Когда четыре пластины были переданы, центрифуги пластин при 500 оборотов в минуту в течение 1 мин. Супернатант использованием 96-контактный вакуумный отсасыватель, оставляя ~ 25 мкл жидкости и червей осадок на дне колодца. Добавить 150 мкл 40% изопропанола в каждую лунку, чтобы исправить животных. Убедитесь, что пипетка находится на достаточно высокой скорости смешать червягранул с 40% изопропанола. Выдержите при комнатной температуре в течение 3 мин. Центрифуга пластины обнаружены в 500 оборотов в минуту в течение 1 мин. Супернатант использованием 96-контактный аспиратором или вручную, оставляя только 25 мкл 40% изопропанола + червь осадок на дне колодца. В каждую лунку, добавить 150 мкл Нила красящий раствор красного готовят непосредственно перед применением: 6 мкл Нила красного раствора 0,5 мг / мл в ацетоне на 1 мл 40% изопропанола. Печать плиты с нестерильных клейкой пленки и пятно в темноте в течение по крайней мере 2 часа. 8. Вымойте и изображения черви на высокой пропускной способности микроскопа Центрифуга при 500 оборотов в минуту в течение 1 минуты и удалите все, кроме 25 мкл Нил красным красителем. Добавить 150 мкл PBS с 0,01% тритона Х-100 в каждую лунку и хранят в темноте в течение по крайней мере 30 мин. Центрифуга при 500 оборотов в минуту в течение 1 мин. С помощью 12-канальной пипетки, аспират животных от нижней части каждой лунки с 2 х 7 мкл быстроинсультов и обходиться на 96-луночные с тефлоновым печатных стекло. Осторожно, без удаления червей, удалите 9,5 мкл PBS из каждой лунки слайда. Если стекло не подходит прямо в микроскоп горе, пользовательские обработанной держатель слайдов алюминия должна быть использована для монтирования червей. Медленно опустите крышку слайд на 96-и слайд. Этот шаг может потребоваться некоторая практика, чтобы избежать пузырей или переходить червей в других скважинах. Безопасные уголки с клеем тактику. Изображение слайда в светлом поле и флуоресценции с GFP / FITC фильтр установлен на автоматизированной микроскопии. Фотоотбеливатели липидов сигнал легко поэтому она должна быть отображена на системной основе во всех скважинах, а не вручную, как фотообесцвечивания приведет к искусственному различия между скважинами. Для более подробной информации о анализа, см. представителя Результаты и обсуждение. 9. Биохимические определения липидов методом твердофазной экстракции (SPE) и газовой хроматографии-масс-спектрометрии (GC / MS) <p class="Jove_content"> Для проверки уровня липидов основана на Ниле красной флуоресценции, газовой хроматографии с масс-спектрометрический анализ (GC / MS) может быть выполнено на метиловых эфиров жирных кислот (FAME), полученных из триглицеридов (TAG) и фосфолипидов (ФЛ) от Червь гранул. Шаги с участием органических должны проводиться в вытяжном шкафу. Следует проявлять осторожность, что липиды находятся в атмосфере азота в защищенном от света во время длительного хранения или инкубации, поскольку они очень уязвимы к окислению. Worm гранул из 2500-5000 синхронных животные используются в качестве входных данных, подготовленная так же, как выше, за исключением, что животные, выращенные на 10 см пластины RNAi. Вымойте 2500-5000 червей каждые 10 см пластины с 10 мл M9 буфера в 15 мл коническую трубку полипропилена. Пелле червей при 500 мкг в течение одной минуты, и мыть гранул снова с 10 мл буфера M9. Пелле животных при 500 х г. Аспирируйте оставив 250 мкл общего объема, и либо замораживание жидким азотом и хранят при -80 ° C в атмосфере азота FOГ последующей обработки или перейти непосредственно. Червь гранулы могут быть приняты непосредственно к этапу 9.3 Если триглицеридов масса должна быть нормирована на фосфолипидных массы 8,13,21. Однако, если следователь желает нормализации содержания белка или ДНК содержания, червь гранулы должны быть ультразвуком на самой высокой интенсивности в ванне ультразвуком в течение 10 мин, 30 сек на, 30 сек выключен, при 4 ° C. Если белок или ДНК, нормализации необходимости удалите в 5 мкл и определить общую концентрацию белка с использованием реагента Брэдфорда или аналогичных или общего содержания ДНК после того, как колонна очистки с использованием УФ-спектрофотометр. Добавить червей до 1,5 мл 2:01 хлороформ: метанол в резьбовых Боросиликатное стеклянной трубки. Все передачи органических растворителей должно быть сделано с помощью стеклянной пипетки. Использование wiretrol 50 мкл пипетки внести 25 нМ фосфолипид стандарт в 50 мкл и 16,7 нМ триглицеридов стандарт в 50 мкл. Оба стандарта должны быть распущен в 2:1 хлороформ: метанол, увенчанный плотно,и хранят в атмосфере азота в защищенном от света в -80 ° C морозильник, чтобы избежать окисления. Кепка с крышкой фенольных и вихрь. Извлечение в течение 1 часа при комнатной температуре, вортексе каждые 15 мин. Центрифуга при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Передача нижней органическую фазу без туши боросиликатного трубки культуры. Добавить 0,3 мл 0,9% NaCl, вихрь и центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Передача нижней органический слой свежего боросиликатного трубки культуры, убедившись, что не передавать на любой из водной фазы. Сухие органической фазы в атмосфере азота. Для начала твердофазной экстракции (SPE) ресуспендируйте сушеные липидов в 1 мл хлороформа. Кроме того, для подробного разделения и анализа различных классов липидов, в том числе фосфолипидных классов, гликолипиды, сфинголипидов, диацилглицеринов, триглицериды, свободные жирные кислоты и эфиров холестерина, тонкослойной хроматографии, как пионером Вт лаборатории в C. Элеганс 22 может быть использован вместо SPE. Липиды также может бэлектронной разделены HPLC и фракции анализировали GCMS. Сложные методы целого lipidome профилирования liquid-chromatography/MS (LCMS) также может быть использована 23-26. Соберите кремния SPE SPE колонке на многообразии. Предварительно равновесие колонки с 3 хлороформа мл. Разрешить растворителя самотеком. Загрузите липидов образца на колонку SPE, сбор проточные в резьбовых боросиликатного трубки как часть первой фракции (TAG фракции). Большинство нейтральных липидов придет через эту первую в 1 мл проточные. Добавьте 3 мл хлороформа в полной мере элюирования TAG фракции, сбор проточные в трубке фракции TAG. Удалите и ограничить первая труба коллекции, и заменить чистую пробирку коллекции. Элюировать гликосфинголипиды с 5 мл 9:1, ацетон: метанол. Мы не регулярно анализировать состав жирных кислот в этой фракции, однако, могут содержать ценную информацию и могут быть сохранены для подготовки метиловых эфиров и свободных оснований sphingoid для дальнейшего анализа использованияспециализированных процедур, отличных от тех, для TAG и PL, как описано выше 27. Заменить гликосфинголипид трубки коллекции со второй резьбовой трубки боросиликатное коллекции. Элюировать фосфолипидов с 3 мл метанола (PL фракции). Фракции могут храниться при -80 ° C на данный момент ограничен тесно в атмосфере азота. Сухой очищенный липидов в атмосфере азота. Для ускорения сушки, в сухом блок нагревания при 33 ° C. Никогда не храните липидов в сушеном виде, так как они особенно чувствительны к окислению в высушенном состоянии. Ресуспендируют сушеные фракций липидов в 2 мл 2% H 2 SO 4 в метаноле встряхиванием и инкубировать ограничен плотно на ночь в 55 ° С водяной бане, чтобы создать МЭЖК. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы получить абсолютно никакой воды в FAME реакции, как это будет в значительной степени тормозят производных липидов. Мы нашли более эффективный производных от инкубации в течение ночи и литературы показывает, менее окисления липидов происходит при более низких температурах Дуринг FAME подготовки 28. Альтернативный и более быстрый способ заключается в использовании 2 мл 2,5% H 2 SO 4 в метаноле и derivatize в течение одного часа при температуре 70 или 80 ° C 21,22,29. На следующее утро, снять с бани и дать остыть. Добавить 1,5 мл H 2 O (для гашения реакции), а затем 0,3 мл гексана (для извлечения МЭЖК) для каждого тега и PL фракции. Встряхнуть и центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Очень осторожно снять только верхний слой гексана с использованием стандартной пипетки или пипетки Пастера. Разлить в трубке пробоотборником. Убедитесь в том, чтобы не включать любой подкисленный метанол, так как это разрушит GC колонны и MSD. Cap и нагрузки на образцы GC / MS. Образец передается в гексане, микро-вставки Agilent флакон увенчан PTFE-силиконовой PTFE крышкой. Он передается на модели Agilent GCMS 6890/5973N оснащен Supelcowax-10 (24079) 30 метров, 250 микрон плавленого кварца капиллярной колонкой. Один мкл вводят IntО.А. без деления входе установлен на уровне 250 ° C и 13,33 PSI Ultrapure Гелий используется газ-носитель. Протокол выполнения выглядит следующим образом при постоянном 1 мл в минуту: Шаг Инструкция Цель температура 1 Держать 2 мин 150 ° C 2 Ramp 10 ° C в минуту 200 ° C 3 Удерживайте 4 мин 200 ° C 4 Ramp 5 ° С в минуту 240 ° C 5 Удерживать 3 мин 240 ° C 6 Ramp 10 ° C в минуту 270 ° C 7 Держи 5 мин 270 ° C 3 мин растворитель задержка используется при MSD чтобы свести к минимуму износ филидиот. После этого массу от 50 до 550 дальтон обнаружены с MS четверка набор при температуре 150 ° C и источник мс установлен на уровне 230 ° C, с тепловой вспомогательных температуре 270 ° C.

Representative Results

Пример отображаемого пластины, которые были приняты через жиров рабочий процесс окрашивания показано на рисунке 1. Конкретные контроль за высоким содержанием жира (DAF-2 рецептора инсулина RNAi), низким содержанием жира (LPD-3 белка, необходимые для хранения гранул липидов в кишечнике RNAi), малый и низким содержанием жира (FASN-1-синтазы жирных кислот РНК-интерференции), и пустой вектор ( управления) показывают изменения в интенсивности флуоресценции в зависимости от жира животных, и соответствующее количество липидов определяется GC / MS анализа (рис. 2). Обратите внимание, что ген бездействия, ведущие к умственно арестован, мелкие животные часто, как представляется, гораздо меньше жиров, чем взрослых животных контролем, независимо от какой-либо связи с метаболизм жиров (рис. 3). Вторичный анализ, включая анализ окрашивания и биохимии липидов с SPE-GCMS дикого типа контрольных животных аналогичной стадии развития должно быть сделано для обеспечения достоверностималенькие или умственно арестован положительные хитов. В случае FASN-1 РНК-интерференции (рис. 2), животных арест либо в L2 или L3 личиночной стадии, и есть жир окрашивания ниже, чем взрослые управления RNAi, но похоже в изобилии L2-L3 этапе контроля RNAi животных (жир пятно процентов взрослого контроля RNAi: 49,9 ± 4,5% для FASN-1 РНК-интерференции и 20,2 ± 2,1% для L2 контроля RNAi и 64,7 ± 1,3 L3 для управления RNAi). Кроме того, биохимический анализ показал более низкую TAG / PL отношение, чем этап L2 соответствует животных N2 управления (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 для FASN-1 РНК-интерференции и 46,1 ± 3,4 на стадии контрольной РНК-интерференции, Р ≤ 0,05). Таким образом, в данном случае это может быть подтверждено, что биохимический анализ FASN-1 играет важную роль в липидном хранения, а не просто этапом конкретных снижению жировой массы. Последующий анализ распечатанных червей опирается на вычислительные платформы, такие как сотовый Profiler использованияWormToolbox 30. Для меньшего числа изображений, общедоступной платформе анализа изображений, таких как ImageJ, в свободном доступе в NIH, могут быть использованы. Для нашего анализа, уникальные сценарии Matlab были использоваться в первую очередь для идентификации хорошо, а затем, чтобы исключить пустые скважины или тех, с пузырьками, и различать мелкие обломки от червей. Ручное управление качеством было необходимо для изображения попадает в исключения по причинам, указанным выше. Мы нашли эмпирически, что 90-й процентиль интенсивности пикселей червя через колодец, нормированный на червя по всей области и, при условии последовательного метрики интенсивности окрашивания на всех этапах развития червя (рис. 3). Интеграция общей жировой массы по площади червей, наоборот, будет стремиться забить маленькие яркие червей самое с большой тусклый червей. Потому что наш метод не обеспечивает интеграцию общего флуоресцентного сигнала по площади червь, принимая интенсивность процентиль, изменения размеров червя само по себе не делаютт смещение интенсивности измеряется. Вместо этого, различия в распределении интенсивности пиксела измеряется. Однако, несмотря на это, выраженные различия наблюдаются в окрашивания пикселя распределение интенсивности между животными разных стадиях развития, поэтому важно, чтобы изучить эффект РНК-интерференции для любого гена в отношении животных сопоставимо стадии развития (рис. 3). Средняя изменчивость между повторяет показано на рисунке 4 указывает на высокую воспроизводимость жира методом окрашивания. Обратите внимание, что сила метода сильно зависит от получения качественных изображений для каждой пластине, в одинаковых условиях освещения, используя одинаковое время экспозиции, и с минимальным пузыри, мусор, или кроссовер червей в других скважинах. SPE проводили на предварительно смешанные, очищенный стандартов для определения степени, в которой метки могут быть отделены от PLs (рис. 5). В этом анализе, мы достигли 100% сeparation от TAG и PL, как указано полное отсутствие 17:00 жирных кислот, полученных из PL в TAG образца и соответствующая полному отсутствию 13:00 жирных кислот, полученных от TAG в образце PL (рис. 5). Таким образом SPE является весьма эффективным на разделение липидов классов. Этот анализ не означает, что все метки разной длины цепочки будут очищены самое, SPE и обнаружить GCMS с одинаковой эффективностью. Это только гарантирует, что TAG и PL липидов в общем полностью отделены друг от друга. Образец GC-MS след N2 диких животных типа принято через твердофазной экстракции и слава препарата показано на рисунке 5В. Для обоих TAG и PL, пики могут быть определены основанные на времени удержания и материнских и дочерних ионов на масс-спектра, а общая площадь выявленных пиков нормированы на площадь соответствующих внутренних стандартов. Для определения нормированной суммы TAG, областьпри всех пиков хроматограммы TAG, кроме стандартного 13:00, были добавлены вместе и делится на площадь под пиком 13:00. Кроме того, для определения нормированных общую сумму PL, площадь под все вершины, кроме стандартного 17:00, были добавлены вместе и делится на площадь под пиком 17:00. Нормированные значения для TAG и PL образцы затем используется для расчета окончательной TAG / PL соотношение образца: Следует отметить, что данные SPE-GCMS позволяют гораздо более сложный анализ жирных кислот, присутствующих в каждой липидной фракции, чем простой подсчет общего TAG отношение к PL. Например, следователь может интегрировать одного пика, соответствующего одной жирной кислоты и сравнить ее нормированная на обилие образцов (например, сomparing в N2 дикого типа по сравнению с DAF-2 RNAi интегрированной площади 18:00 пика, деленная на 13:00 стандартный пик, нормированная к общей массе PL PL делится на 17:00 площадь стандартного пик): Если следователь выбрали, это также можно было бы определить процент того или иного жирных кислот в тег или PL фракций в процентах от общего количества жирных кислот количественно (в качестве примера в 18:00 TAG фракции в N2 червей ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"ALT = "Рисунок 1" FO: содержание ширина = "3.25in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg" /> Рисунок 1. Типичный рабочий процесс для всего эксперимента. 1 день, замороженные RNAi библиотеки пластины штамп на Amp / Tet пластин LB агаром и инкубировали при 37 ° C. День 2, А / Tet пластины используются для семенной жидкости культур RNAi клонов в глубокий колодец блоков. День 3, бактерии концентрируют центрифугированием и переносили в 96-луночный RNAi пластин. День 4, L1 детеныша C. Элеганс добавляют в RNAi пластин в жидкость и дают высохнуть. День 7, животных, собранных в жидкости, окрашенные красным Нила в 40% изопропанола, установленный на 96-и слайды тефлон, и полученную с высокой пропускной способностью микроскопа. Рисунок 2. Фиксатор на основе Нила красные пятна основных <em> C. Элеганс жировые запасы. представитель светлого поля и флуоресценции GFP изображения отображаются в N2 черви питаются FASN-1 (малый, обезжиренные), LPD-3 (низкой жирности), контроль (пустой вектор), или DAF-2 (с высоким содержанием жира) RNAi клонов. Образцы были обработаны в соответствии с протоколом (схема на рисунке 1). Животные фиксированной, окрашенных в красно Нила, и отображаемого результата в сопоставимых уровней липидов, полученных от биохимического анализа липидов. Изопропанол фиксированной Нила красной флуоресценции уровней, приобретенные по меньшей мере, 6 биологической репликации, приведены в первом ряду. Количественные уровни триглицеридов, отражающие общую нейтральную магазинах липидов, когда нормированная на общий уровень фосфолипидов (TAG / PL), взятых из 4 биологической репликации, приведены во втором ряду. Важно отметить, что абсолютное количественное достигнута с фиксатором Нила красное окрашивание и биохимических определение липидного часто не соответствуют отлично. В этом случае, хотя и качественнопохоже, FASN-1 (RNAi) имеет более различной массы триглицеридов по сравнению с контролем биохимическими методами, чем указано микроскопии, LPD-3 является сравнительно разные, и DAF-2 (RNAi) меньше, разные, хотя все различия высоко статистически значимыми и Измерения были очень воспроизводимые. Данные представляют собой средние ± SEM (*, Р ≤ 0,01; ** Р ≤ 0,0001 по сравнению с контролем, определяется по непарным, двусторонний T-тест предполагая равные дисперсии). Рисунок 3. Жировая масса определяется путем фиксации Нила красное окрашивание в различные личиночной стадии. Животные были выращены на OP50 бактерий и собранные на L1, L2, L3, L4 и беременных взрослых стадиях развития. Изображения были захвачены после записи окрашивания и проанализированы с помощью пользовательского сценария Matlab для определения 90-й процентиль оF интенсивности пикселей за выявленные червь области. Обратите внимание, что уровни липидов животных значительно увеличить как животное развивается из L2-L4 этапе, а затем несколько снизится, как животное начинает отвлекать калорий в сторону распространения зародышевой линии во взрослой стадии. Данные представляют собой средние ± SEM в течение 6-8 повторяет (**, р ≤ 0,0001 по отношению к беременной взрослых, определяется непарный, двусторонний T-тест). Рисунок 4. Высокая воспроизводимость через независимые биологических повторностях. Показана точечный график Нила красной интенсивности флуоресценции через биологические повторяет (п = 6-8). Для каждого из одинаковых, все значения приведены к средней интенсивности пустой управления вектором. Данные представляют собой средние ± SEM (**, р ≤ 0,0001 по сравнению с контролем, определяется по непарным, двусторонний T-тест предполагаяравные дисперсии). Рисунок 5. GC-MS хроматограммы SPE отдельных стандартов и диких TAG типа и PL изобилия. (A) GC-MS следов показаны на SPE разделения тегов и PL стандартам. Обратите внимание на полное отсутствие 13:00 жирных кислот в след PL и соответствующее отсутствие 17:00 жирных кислот в TAG след, указывающий полное отделение TAG (tritridecanoin) от PL (1,2-diheptadecanoyl-Sn-глицеро -3-фосфо-(1'-рац-глицерин)). (B) представитель полный спектр TAG и ФЛ образца N2 дикого типа животных, получавших векторного управления RNAi (HT115 бактерий с L4440 пустой вектор RNAi). Один мкл образца вводили в Agilent 6890/5973N GCMS в соответствии с протоколом, а отдельные вершины были определены ReteВремя ntion и их масс-спектров. Сокращения: цикло, циклопропан жирные кислоты; ISO. ISO-метил разветвленные жирные кислоты; GLA, гамма-линоленовая кислота, ALA, альфа-линоленовая кислота; DGLA, дигомо гамма-линоленовой кислоты, EPA, эйкозапентаеновая кислота Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Discussion

Представленный протокол позволяет быстро, большие масштабы скрининга уровня липидов в C. Элеганс, которые могут быть легко адаптированы для экранов с высоким пропускную способность. В отличие от ранее используемых методов, которые предполагают длительные шагом фиксации в параформальдегид последовало несколько циклов замораживания-оттаивания 8,10, наш протокол требует простого 3-мин фиксации в изопропанол. Мы обнаружили, что путем окрашивания C. Элеганс в 40% изопропанола, они становятся свободно проницаемыми для Нила красный, без использования дополнительного замораживания-оттаивания или фиксации шаги. Кроме того, как Нил красным выборочно флуоресцирует в гидрофобных отсеков в зеленом спектре 18,19,31, не destaining необходимо. В общем, животные могут быть взяты из пластин RNAi для окрашенных и готовы к животным изображение всего за 2,5 часа. Этот метод может быть выполнена относительно недорого и с высокой воспроизводимостью. Метод не зависит от способности C. Элеганс к поглощению или концентратакрасителя, и поэтому не имеют те же ограничения, как кормление методы, основанные на использовании витальных красителей. С учетом воспроизводимости и точности измерений, метод пригоден для скрининга большого числа генов бездействия по RNAi. Если количественное определение уровней липидов желательно основанный на фиксатор окраски Нил красным, мы рекомендуем использовать 4-6 биологических повторяет с соответствующей контроля и статистической проверки применяется.

Вполне вероятно, что многие бездействия гена приводит к небольшим животным (в связи с RNAi клоны вызывают задержаны или арестованы развития) выйдет из экрана жира регуляторов, независимо от подключения к жировой обмен. Хотя программа анализа изображения мы использовали счета для червей разных размеров путем нормализации интенсивности флуоресценции на червя области, отдельные исследователи также можете рассмотреть сравнения жира окрашивания мелких животных на диких животных типа похожие стадии развития. ВПри малых или развитием арестован животных с очевидными низкой жировой массы, мы полагаем, что не существует единственного метода достаточно, чтобы продемонстрировать измененного метаболизма липидов. Несколько последующих экспериментов, в том числе SPE-GCMS, могут потребоваться для установления липидов регулирующей функции этих генов. Для известных метаболический регулятор FASN-1, SPE-GCMS анализа по сравнению с развитием соответствующих N2 L2 контрольных животных были необходимы, чтобы подтвердить очевидное обезжиренный фенотип найдено по сравнению с взрослыми животными управления. В то время как Нил красной окраски жира указано ниже жира по сравнению с контролем взрослых RNAi, по сравнению с этапом соответствием L2 контроля RNAi животных, без видимой разницы не было видно. Соответственно, использование второго способа, то есть биохимических количественного TAG / PL соотношение было необходимо определить, что FASN-1 является истинным регулятором жировой массы, а FASN-1 РНК-интерференции является биохимически отличается от стадии соответствует L2 контрольных животных RNAi.

<p cдевушка = "jove_content"> В то время как мы представляем визуализации и обработки данных для высокой пропускной способности платформы, обычный прямой микроскоп может быть легко использована для захвата изображений с червями устанавливается на агарозном колодки 20 или на обычных размеров с тефлоновым печатной 8 до 12 и слайды микроскопом . Единственным ограничением является то, что, как зеленая флуоресценция липидные капли окрашивают Нила фотоотбеливатели красной быстро, систематически, единых условиях воздействия должны быть использованы для обеспечения сопоставимости между изображениями. Мы считаем, что полностью автоматизированный микроскоп с единых условий получения изображения лучше всего работает в этом направлении.

Одной из самых сильных сторон этого протокола является то, что после того, как изображения собраны они могут быть сохранены для дальнейшего повторного анализа. То же изображение может быть использован для определения размера тела в дополнение к жирности. Кроме того, как вычислительные программы становятся все более продвинутые, есть перспектива для одного анализа червя, создавая статистически значимых результатовиз одной скважины. Таким образом, наш метод, который использует высокую пропускную способность микроскопа имеет некоторые преимущества по сравнению с опубликованной экрана методологий, которые используют Copas Biosort количественно флуоресцентные сигналы 32,33. Тем не менее, методики, безусловно, бесплатный.

Точные, биохимические определения содержания липидов по SPE и GC / MS подтверждает окрашивания Нила красной основные запасы жира в C. Элеганс. Хотя абсолютное количественное достигнута с фиксатором Нила красное окрашивание и биохимических определение липидного часто не соответствуют отлично, оба метода дают высокую воспроизводимость, статистически значимые результаты, которые качественно согласуются. Кроме того, этот метод может быть адаптирована для удовлетворения конкретных потребностей отдельных исследователей, которые могут потребовать дальнейшего анализа отдельных классов гликосфинголипиды, фосфолипиды, триглицериды или присутствует в различных образцах. Следует отметить, что другие группы используют технологию другим тхап SPE разделить классы липидов до GC / MS 22. Тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) имеет преимущества перед SPE в том, что они могли бы лучше отдельный различных нейтральных липидов (например, TAG, диацилглицеринов, свободных жирных кислот и эфиров холестерина) из полярных липидов (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин) и гликоля сфинголипидов. Мы выбираем SPE, поскольку он требует минимального исходного материала (2500-5000 черви), он подчеркивает крупные долгосрочные запасы энергии, теги, которые составляют большую часть нейтральной липидной фракции 4 и быстрый, не требующий специального оборудования или пластинами. Следует подчеркнуть, что на основе стандартных смесей, SPE полностью отделяет теги PLS, и очень воспроизводимые и надежные (см. рис 5А). В то время как количественное и анализ метиловых эфиров жирных кислот требует GC / MS, это оборудование широко доступной, и если не локально, то пробы могутбыть получены, как указано выше и хранили при -80 ° C в атмосфере азота до анализа соавтором или коммерческая GC / MS службе устроено.

Выход GCMS содержит данные с высоким разрешением на каждой жирной кислоты внутри каждого вида липидов. Это позволяет определить подробные различия между образцами сравнивать. Например, следователь может определить, является ли уровень определенных жирных кислот были изменены в изобилии в большей степени, чем другие, в DAF-2, LPD-3 или FASN-1 РНК-интерференции по сравнению с векторным управлением. Это чрезвычайно мощный инструмент, поэтому может предоставить подробную информацию о которых липидного видов изменены в изобилии с любой экспериментальной манипуляции.

Для нашего анализа мы чаще всего нормализовать TAG к массе PL. В то время как белки или ДНК также могут быть использованы для нормализации липидного массы после определения из аликвоты ультразвуком червь гранул, мы находим, что эти методы могут быть Introduced человеческой ошибки во всех пипетки шаги и в образце восстановления от каждой добычи. Именно по этой причине мы решили вместо этого использовать PL массы, как наши нормализации фактор. Неестественный стандарты введены в начале протокола (tritridecanoin для TAG, 1,2-diheptadecanoyl-Sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) для PL) осуществляется через все шаги твердофазной экстракции и FAME подготовки, а также гарантировать количественный и представитель восстановления и TAG и PL фракций. То же гарантия не может быть сделано, если исследователи используют белок или ДНК, чтобы нормализовать TAG массы. Мы считаем, PL, чтобы быть самым надежным мера, которой для сравнения TAG уровней в образцах, как было ранее показано, что PL только детально изменены и тот же раздражитель осуществления большие сдвиги массы в TAG уровнях, например, расширенные голода или увеличить упражнение 34 – 36. PL, как полагают, играют структурную роль, обеспечивая текучесть мембран и клеточных инgrity и сигнализации ролей, а не как накопление энергии 37-39. В наших руках, TAG / PL отношение наиболее близко соответствует тому, что получается фиксатором на основе липидов окрашивания Нила красные, и соглашается с найденным другими группами 21. Альтернативная стратегия используется Вт лабораторию, где процент липидов TAG рассчитывается в зависимости от общих липидов 9,22,29.

Использование неродного типа ТКГ и PL стандартных гарантирует, что ни родные жирных кислот будут включены в нормализации расчетов. Выбор длины цепи основывается исключительно на необходимости эти стандарты не вмешиваться в масс-спектрах родной жирных кислот. Мы обнаружили, что жирные кислоты 13:00 и 17:00 служить лучшим для этой цели. Вполне возможно, учитывая различные химические свойства короткие цепочки жирных кислот, что наши неестественные жирные кислоты стандартов не может быть представителем восстановление всей цепочки длиной жирных кислот или цепи с разн.различны индексы насыщения. Таким образом, не исключено, что во время SPE или GCMS мы могли бы видеть различия в эффективности очистки или обнаружения между липиды различной длины цепи. На основании этого и различные ионизации различных жирных кислот в GCMS, это не возможно сделать абсолютное утверждение об изобилии любой жирной кислоты. Таким образом, мы только сравнить между образцами в рамках одного эксперимента содержания того или иного жирные кислоты. Если человек хочет абсолютно количественного жирные кислоты, одного образом это может быть достигнуто было бы запустить образец, полученный, как указано выше шипами с известным количеством стабильно меченных изотопами 13 C версия, что о похожих жирные кислоты, так что это может быть отличается основана на массу родительского иона в MSD, например. Учитывая то, что мы только сравнивая относительные количества липидов классов или любой жирной кислоты, наша TAG 13:00 и 17:00 стандартам PL служить этой цели адекватно, как минимум стоимости, вобеспечить адекватное и представитель восстановление липидного каждый класс.

До этого момента, было отсутствие консенсуса относительно толкования определенных результатов, полученных разными методологиями, и к тому, что преобладающей методологии должно быть. В целом, это следует отметить, что ни один метод в отдельности идеально подходит для изучения метаболизма жиров в C. Элеганс. Тем не менее, с помощью нескольких отбора и проверки условий, можно добиться уверенности в данных, полученных на липидный регуляторных генов. Таким образом, мы намерены для нашего протокола, чтобы служить в качестве ориентира для будущей работы в области C. Элеганс жира исследований.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Майкла Kacergis для оказания технической помощи и Lianfeng Wu для обсуждения и чтение рукописи. Эта работа была поддержана наградой развития карьеры от NIH / NIDDK (K08DK087941 для AAS), NIH / NIDDK подготовки гранта (5T32DK007028 к ECP), Эллисон Медицинский фонд Новой Академии в процессе старения Award (для AAS) и Чарльз H . Hood Foundation ребенка Health Research Award (для AAS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
96-pin replicator Nunc 250520
LB Agar US Biologicals L1500
Agarose Invitrogen 16500500
Mechanical Pipettors Biohit M Line M10, M100, M300
Electronic Pipettor Biohit E Line E1200
1 M KH2PO4 Sigma P0662 pH 6.0 Sterilized by Autoclaving
1 M MgSO4 Sigma M2643 Sterilized by Autoclaving
1 M CaCl2 Sigma C2661 Sterilized by Autoclaving
NaCl Sigma S5886
5 mg/ml Cholesterol Sigma C8667 In 100% Ethanol
200 mg/ml Carbenicillin US Biologicals C1100 Filter Sterilized 0.2 μ
1 M IPTG US Biologicals I8500 Filter Sterilized 0.2 μ
100 mg/ml Ampicillin Filter Sterilized 0.2 μ
5 mg/ml Tetracycline In 100% Ethanol
Bacto Agar BD 214040
96-well TC Plates BD-Falcon 353072 For 96-well RNAi
Rectangular A/T Plates Thermo Scientific 242811 For stamping RNAi
LB Media US Biologicals L1530 Prepared as per manufacturer instructions
96-well Deep Well Assay Blocks Corning Costar 3960 Rectangular V-bottom assay block
96-well Shallow Well Assay Block Corning Costar 3956 Round V-bottom assay block
Sterile Sealing Film VWR 89134-432
Aluminum Sealing Film Corning Costar 6570 Thermowell Sealing tape for 96-well plates
M9 Buffer See Hope et al.20 See recipe below
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Nile red Invitrogen N-1142
Isopropanol Fisher BP2632-4
96-pin aspirator VP Scientific VP177A-1
96-well Teflon Masked Microscope Slides Thermo Scientific Custom Can also order Trevigen 96-well Cometslide
96-well Gold-Seal Coverslides Thermo Scientific Custom Can also use second 96-well Cometslide
Deep-well PCR plate VWR 89049-178
Non-sterile adhesive film VWR 60941-070
High-Throughput Microscope Leica DM6000 fully automated with Prior 96-well stage With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective
Bath Sonicator Diagenode Bioruptor XL
Chloroform Sigma 366927-4L
Methanol Fisher Optima F456-4
Phospholipid Standard Avanti Polar Lipids 830456P 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)
Triglyceride Standard NuChek Prep T-135 tritridecanoin
Wiretrol 50 μl Pipet Fisher 21-176-3A Drummond Scientfic
Acetone Sigma 320110-4L
Sulfuric Acid Fisher A300-500
Hexane Fisher Optima H306-1
SPE Silica Column Thermo Scientific 60108-317 Hypersep SI, 100 mg resin bed
Solid Phase Chromatography Manifold Sigma 57265 Supelco Visiprep 24-DL
Borosilicate Pipets Fisher 13-678-27F 10 ml size
Borosilicate Pasteur Pipets Fisher 13-678-8B
Borosilicate Culture Tubes Fisher 14-961-27
Threaded Borosilicate Tubes VWR 14235-460 8 ml capacity
Phenolic Caps for Culture Tubes Fisher 14-823-211
GC/MS Autosampler Vials Agilent 5188-6592
Caps for Autosampler Vials Agilent 5185-5861
GC/MS Agilent 6890 GC / 5973 MSD Outfitted with a Supelcowax-10 column

Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
NaCl 3 g
Agarose 17 g
Bacto peptone 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
1 M MgSO4 1 ml
5 mg/ml cholesterol 1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6.0) 25 ml
1 M CaCl2 1 ml
200 mg/ml carbenicillin 1 ml
1 M IPTG 5 ml
Dispense into 96-well RNAi plates. Store at 4 °C until use, up to 2 weeks.

Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
LB agar (US Biologicals) 32 g
2 M NaOH 1.5 ml
Bacto agar 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
Tetracycline 3 ml
100 mg/ml Ampicillin 0.5 ml
Dispense 45 ml into each plate. Store in dark at 4 °C until use, up to 4 weeks.

LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks

Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy.

100 mg/ml Ampicillin

Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Tetracycline

Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container.

200 mg/ml Carbenicillin

Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Cholesterol

Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months.

1 M MgSO4

Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M CaCl2

Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M KH2PO4, pH 6.0

Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches

Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature.

10 N NaOH

Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature.

1 M IPTG

Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation

Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use.

Nile red stock solution

Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner.

Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates

Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use.

Phospholipid Standard

Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

Triglyceride Standard

Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
  3. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
  4. Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
  5. Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
  6. Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
  7. Wang, M. C., O’Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
  8. O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
  9. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
  10. Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
  12. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
  13. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
  14. McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
  15. Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
  16. Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
  17. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
  18. Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
  19. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  20. Hope, I. L. . C. elegans: A Practical Approach. , 304 (1999).
  21. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
  23. Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
  24. Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
  25. Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
  26. Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
  27. Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
  28. Christie, W. W. . Advances in Lipid Methodology – Two. , 69-111 (1993).
  29. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  30. Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
  31. Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
  32. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
  33. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
  34. Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
  35. Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
  36. Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
  37. Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
  38. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  39. Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).

Tags

Caenorhabditis ElegansLipid DropletsNile Red StainingHigh-throughput MicroscopyTriglyceridesPhospholipidsGas Chromatography-mass Spectrometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image