Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос
Summary
Тканеспецифическая анализ регенерации волосяных фолликул модели с использованием лентивирусов посредником усиления или потерей функции.
Abstract
Волосяной фолликул морфогенеза, сложный процесс, требующий взаимодействия между эпителием полученных кератиноцитов и основные мезенхимы, является привлекательной моделью системы для изучения развития органов и тканей конкретных сигнализации. Хотя развитие волосяных фолликул генетически послушный, быстрый и воспроизводимый анализ факторов, необходимых для этого процесса остается проблемой. Здесь мы опишем процедуру создания целевых гиперэкспрессией или ShRNA-обусловленный нокдаун факторов с использованием лентивирусов в ткань определенным образом. Использование модифицированной версией модели регенерации волос 5, 6, 11, мы можем достичь надежного усиления или потерей функции анализа в первичных кератиноцитов мыши или кожные клетки для облегчения изучения эпителиальных мезенхимальных сигнальных путей, которые ведут к волосам морфогенез фолликула . Мы опишем, как изолировать свежих первичных кератиноцитов мыши и кожных клетках, которые содержат кожные клетки сосочков и их прекурсоров, доставить лентивирус ContaiНин либо ShRNA или кДНК одной из клеточной популяции, и объединить клетки для создания полностью сформирован волосяных фолликулов на спинах голых мышей. Такой подход позволяет провести анализ тканей специфические факторы, необходимые для создания волосяных фолликулов в течение трех недель и обеспечивает быстрый и удобный компаньон для существующих генетических моделей.
Protocol
1. Подготовка 0 до 2 дней новорожденных мышей для кожи Dissection Усыпить мышь щенков использованием CO 2 камеры по меньшей мере 20 мин. Оставьте щенка на льду до часа, пока рассечение. P0-P2 мышей настоятельно рекомендуется как клетки получают из старых мышей сократили предшественников мощности, что приводит к снижению трансплантата урожайности. Подготовка одно блюдо из 70% этанола (за шагом 1,3) и три блюда промывочного раствора (для шага 3), когда будете готовы выполнить кожи рассечение. Оттепель диспазы решение и оставить его при 4 ° C. Шейки вывихнуть щенков после CO 2 передержки для обеспечения эвтаназии. Поместите эвтаназии щенков в культуре блюдо на льду и передачу в стерильную капот потока. Мыть щенка коротким погружением в 70% этанола и место на стерильную чашку культуры. 2. Проанализируйте кожу мыши Отрежьте каждой конечности и хвост у основания туловища стерильными ножницами. Возьмитесь за телом твердо между парой у.е.rved пинцетом и сделать надрез вдоль спины кожу от головы до хвоста с помощью скальпеля, не проникая основной панели. Тщательно очистите кожу от средней линии мышей. Возьмитесь за подвергаться мыши крепко длинной стороне изогнутых щипцов и вставить еще пару изогнутых щипцов под кожей на заднем конце мышью и осторожно потяните кожу на бедрах к вентральной половины мыши. Тщательно очистите кожу полностью от мышей одним плавным движением и выбросить тушу. 3. Промойте кожу и инкубировать с Решение диспазы Поместите коже в первые блюда промывочного раствора с дерма-вниз. Распространение кожи, и агитировать щипцами. Оставьте кожу в первом блюде промывочного раствора при вскрытии следующем кожи. После размещения следующем расчлененный кожи в первые блюда промывочного раствора, передает перед коже второе блюдо промывочного раствора. Хранить шкуры в гоE Второй промывочного раствора, пока все скины собираются. Передача всех скины для последней промывки агитировать кратко. Добавить 10 мл ледяной диспазы в стерильный 10 см блюдо культуры. Передача кожи диспазы решение и выровнять кожу дермы стороной вниз. Поплавок кожи в течение 8-16 ч при 4 ° C (альтернативный вариант: 1 час при 37 ° C). 4. Отдельные дермы и эпидермиса Передача кожу на новую стерильную чашку культуры и выровнять кожу дермы стороной вниз. Осторожно удерживайте дерму из угла в угол с помощью скальпеля. Возьмитесь за эпидермис пинцетом и медленно от дермы. Эпидермис должна отслаиваться как одно целое. Эпидермис будет белой и тонкой и дермы должны быть коричневатые, толще и студенистое. Отделите две ткани на отдельные стерильные чашки культуры. Для того, чтобы кожная конкретного гена нокдаун / гиперэкспрессия взяточничество, принять дермы и фарш на очень маленькие кусочки с тгоре скальпелей. Откажитесь эпидермиса. В день инфекции (стадия 7), рассекают другой набор мышь скины для подготовки свежих, необработанных клетках эпидермиса сочетать с лентивирусов-инфицированных кожных клеток. Для того, чтобы эпидермиса специфического гена нокдаун / гиперэкспрессия трансплантата, нарежьте каждый эпидермис в 6 – 8 мелкие куски. Откажитесь дермы. В день инфекции (стадия 7), рассекают другой набор мышь скины для подготовки свежих, необработанных кожных клеток в сочетании с лентивирусов-инфицированных клеток эпидермиса. 5. Диссоциируют Первичные кожные клетки мыши (Главгосслужбы Украины) из измельченной ткани Диссоциируют Главгосслужбы путем инкубации кожной части с недавно сделанным раствором коллагеназы при 37 ° С в течение 1 часа. Используйте 10 мл раствором коллагеназы на мышь щенка. Осторожно перемешайте раствор, содержащий дермы каждые 10 мин. Проверьте степень диссоциации под микроскопом; переваривается клеточной суспензии должна быть главным образом отдельные клетки. Решение должно измениться ясно, облачно, каккожные клетки отделены от дермы. Добавить в FBS раствором коллагеназы содержащие дермы на 10% конечного объема для уменьшения активности коллагеназы. Передайте клеточной суспензии через 70 мкм ячейки фильтра в новом 50 мл трубку для удаления крупных непереваренных сгустки и все фолликулы. Добавить 10 мл DMEM/10% FBS за 30 мл проточный дальнейшего разбавления коллагеназы. Центрифужные пробирки, содержащие переваривается дермы на 30 мкг на столе центрифуги в течение 5 мин для дальнейшего удаления целого фолликулов. Тщательно передачи супернатант в новую 50 мл трубки. Гранул клеток путем центрифугирования при 200 мкг на столе центрифуги в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток с DMEM/10% FBS (1 мл на щенка) и подсчета клеток. Пластина клеток с Amniomax C-100 средств массовой информации для инфекции (стадия 7), или сочетать с лентивирус-инфицированных KC для прививки (шаг 9). Типичный выход 20 х 10 6 клеток на щенка. 6. Диссоциируют первичной кератиноцитовс (KC) из измельченной ткани Диссоциируют KC путем инкубации эпидермальный куски свежей талой 0,05% трипсина-EDTA при 37 ° С в течение 15 мин. Используйте 7 мл трипсина-EDTA на мышь щенка. Аккуратно вихрем раствор, содержащий эпидермиса каждые 5 мин. Добавить равный объем нейтрализующим раствором, чтобы трипсина-EDTA содержащие эпидермис к снижению активности трипсина. Гранул клеток путем центрифугирования при 200 мкг на столе центрифуги в течение 5 мин. Осталось непереваренной ткани должны плавать на поверхности. Аккуратно слейте большую часть супернатанта с непереваренной ткани. Удалите оставшиеся супернатанта с 10 мл пипетки, не нарушая осадок клеток. Ресуспендируют осадок клеток с PBS. В случае KCs не осаждали полностью, слейте большинство супернатант и повторите центрифугирования, пока большая часть клетки осаждали. Процедить клеточной суспензии через 70 мкм фильтр ячейки в новую пробирку, чтобы удалить остатки ткани или сгустков. Гранул клеток путем центрифугированияпри 200 мкг на столе центрифуги в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в CNT-07 средств массовой информации или PBS (1 мл на щенка) и количество клеток. Использование CNT-07 для покрытия клетки-инфекции (стадия 7), используйте PBS сочетать с лентивирус-инфицированных Главгосслужбы для прививки (шаг 9). Типичный выход 3-10 х 10 6 клеток на щенка. 7. Infect первичных клеток с лентивирус содержащие ShRNA или кДНК В день инфекция рассекать другой набор мышь скины для подготовки свежих, необработанных первичной KCs или Главгосслужбы сочетать с инфицированные вирусом клетки в день прививки (шаг 9). Для Главгосслужбы, пластины 4 х 10 6 Главгосслужбы Украины в 10-см пластины с AmnioMAX-C100 средств массовой информации и инкубировать при 37 ° C + 5% CO 2 на следующий день инфекцией на 50% плотность клеток. Обычно 3-4 пластин Главгосслужбы используются для создания одного трансплантата, и в общей сложности 10-12 пластин, необходимые для создания трансплантатов три в одном эксперименте. Кроме того, пусть Главгосслужбы приложить и распространять Fили минимум 2 часа при 37 ° C + 5% CO 2 и выполнять инфекцией в тот же день клеточного покрытия. MDCs будет иметь фибробластоподобных морфологии. Для KC, пластины 12 х 10 6 KC на 10-см пластины с CNT-07 средств массовой информации и инкубировать при 37 ° C + 5% CO 2 на следующий день инфекцию. Кроме того, пусть KC приложить и распространяться в течение не менее 2 ч при 37 ° C + 5% CO 2 и выполнять инфекцией в тот же день. Обычно 3-4 пластин KC используются для создания одного трансплантата. В общей сложности 10-12 пластин, необходимых для стимулирования три пересадки в течение одного эксперимента. KCs будет иметь булыжником морфологии. Preincubate клетки в течение 5-10 мин с 8 мкг / мл раствора полибрен при 37 ° C + 5% CO 2. Биржи СМИ и добавить лентивирус + 8 мкг / мл раствора полибрен. Lentiviral титр будет варьироваться в зависимости от построим используются и должны быть определены до заражения. Центрифуга пластинами по 200 мкг на столе центрифуги в течение 1 часа при 32 °, С инфицировать клетки с лентивирусов. Удалить лентивирус содержащих СМИ и добавить свежей информации. Для KC, мыть клетки один раз PBS перед добавлением свежей назад средства массовой информации. Обычно инфицированные клетки восстановиться в течение ночи при 37 ° C + 5% CO 2. Кроме того, позвольте по крайней мере двух часов восстановления при 37 ° C + 5% CO 2 до trypsinizing клеток для пересадки. Продолжайте культуры небольшая часть инфицированных клеток для проверки эффективности инфекции, как описано в разделе представителя результаты. 8. Подготовка инфицированных клеток для пересадки Изолировать свежих первичных Главгосслужбы или KCs из кожи, используя шаги 4-6. Ресуспендируют клеток в ледяной стерильной PBS. Граф клеток. Для кожных конкретного гена нокдаун / гиперэкспрессия трансплантата, диссоциируют инфицированных Главгосслужбы от пластины, используя 0,05% трипсина-EDTA при 37 ° С в течение 8 мин. Для эпидермиса специфического гена нокдаун / гиперэкспрессия трансплантата, диссоциируют инфицированных KC из плит УЗИнг 0,125% трипсина-EDTA при 37 ° С в течение 15 мин. Нейтрализовать трипсина деятельности с использованием DMEM + 10% FBS (Главгосслужбы Украины) или нейтрализующим раствором (KC). Передача трипсинизированных клеток в 50 мл трубки. Гранул клеток путем центрифугирования при 200 мкг на столе центрифуги в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в ледяной стерильной PBS. Граф клеток. Комбинат инфицированные вирусом клетки с свежеприготовленный необработанной типа клеток коллегой. С одной стороны трансплантата, объединить 7-10 х 10 6 Главгосслужбы с 7-10 х 10 6 крон в ледяной стерильной PBS и гранул клетки пульпы в настольные центрифуги при 4 ° C. Ресуспендируют клеток в 50 -100 мкл ледяной стерильной PBS. Держите клетки на льду до Nu / Nu мыши камеры готовы. 9. Создать Bed ран и Fix палаты на спину ню / ню мышь За день до прививки, стерилизацию хирургических инструментов в автоклаве и стерильных камер кремния путем замачивания в 70% этанола. Замените 70% ethaнол стерильной PBS перед использованием камеры. Anesthetize Nu / Nu мыши (7-12 неделя старых самок) с использованием кетамина (8 мг / мл) / ксилазина (1,6 мг / мл) через внутрибрюшинном введении (100 мкл/10 г веса тела) или другим предпочтительным методом. Примените глаз смазки. Место грелку под мышкой. Лечить обнаженной коже спины мышей с йода и протрите спиртом тампоны. Добавить 1-3 капли 0,25% Bupivicaine в месте разреза местно. Зажмите обнаженной коже спины мыши на основание шеи щипцами. Вырежьте маленькие круглые отверстия (~ 1 см в диаметре) в ущипнул кожу стерильными ножницами. Поместить стерильную камеру на рану кровати и крышки отсека края с окружающей кожей. Безопасность камеры в месте со швами вдоль краев камеры (6 стежков в камере), как показано на рисунке 2А. Когда камеры готовы, мягко водоворот суспензии клеток и составляет на 23 иглы прикреплен к 1 мл шприца. Если в ячейке суспензии сконденсировалась на дне, осторожноресуспендируют с 1 мл пипетки, прежде чем делать в иглу. Прокол камеры с иглы и медленно капает клеток на рану. Место мышей в чистую, автоклавного клетки. Дом 2 мышей в клетке и добавлять антибиотики и Tylenol (3 мг / мл) к питьевой воде. По нашему опыту, двух самок мышей в клетке не привели к неблагоприятным травмы камеры, взяточничество или животных. Поместите потепление площадку под половину клетки и наблюдать мышей до анестезии прекратит свое действие. 10. Удалите камеру после 7-9 дней Anesthetize камерных Nu / Nu мыши, как и в шаге 9.1. Примените глаз смазки. Лечить кожу вокруг камеры с йодом и очистить спиртом тампоны. Аккуратно вырежьте стежков и удалить из камеры. Аккуратно снимите камеру с мышью. Если новая пересадка кожи палки в камеру, поднимите часть камеры и осторожно отдельные трансплантата из камеры с помощью пинцета. Держите трансплантата вниз при удалении камеры. Привитые должны туалетеК скучно и непрозрачным, как на рисунке 2B. Применить не соблюдают панель с тонким слоем антибиотиков на открытые раны и шовного на месте (2 стежка). Оберните бинт вокруг мыши, чтобы обеспечить площадку и защитить рану. Шовный повязку на место. Кремния камеры очищаются, вычищая с мягким мылом и тщательно промывают деионизированной водой. Замочите камеры в 70% этаноле в течение ночи, воздух сухой, и магазин. 11. Проверьте мышь для роста волос Удалить бинты и площадки после 3 дней камерой удаления. Привитые должна быть сухой и непрозрачные до коричневого цвета. Проверьте мышь периодически для роста волос. Волосы должны начать показывать на 16 дней после трансплантата. Процедура Outline День 1 (2-3 часа): Sacrifice новорожденных щенков, удалить кожу и оставьте на диспазы при 4 ° С в течение ночи. День 2 (2-3 часа): Изолировать первичных клеток из кожи ипластину, при рекомендуемой плотности клеток. День 3 (3-4 часа): инфицировать клетки с лентивирусов. Удалите кожу от друга набором новорожденных щенков и оставить на диспазы при 4 ° С в течение ночи. 4 день (6-8 часа): Изолировать первичных клеток из кожи, считай, и оставить на льду. Восстановление лентивирус-инфицированных клеток трипсином и центрифугирования, считай, и объединить 7-10 х 10 6 кожных клеток и кератиноцитов в 50-100 мкл PBS за взяточничество. Создать раны кровати на мыши, прикрепить камеру, и применять смесь клеток ранить кровати. Альтернативные процедуры Контуры Альтернативные очертания процедура позволит сократить процедуру от четырех дней до трех. Комбинат День 1 и День 2 обработкой шкур мыши в диспазы при 37 ° C в течение одного часа (расчетное время 5-7 часов). Комбинат День 2 и 3-й день, заражая клетки с лентивирус после посева клеток в течение двух часов (расчетное время 5-7 часов).
Representative Results
На рисунке 1 мы показываем результат кожного конкретных лентивирусные нокдаун ShRNA из сглаживается (SMO), критическая Shh сигнализации компонента, в 3-недельных регенеративной трансплантата волос. Управление трансплантатов использованием лентивирусов вектор одни показывают высокие темпы роста волос (рис. 1А). В отличие от кожных конкретных нокдаун результаты Smo к потере роста волос (рис. 1б). Гематоксилином и эозином изображены сцены из волосяных фолликулов в контрольных и экспериментальных условиях (рис. 1C, D). Фенотип роста волос от подобных процедур может быть переменной между экспериментами, в том числе положительный контроль с лентивирусов вектор Только инфекции. Поэтому положительные трансплантатов управления всегда должна быть включена в каждом эксперименте в качестве эталона 30% трансплантатов может не в результате рубцевания или неполное прикрепление трансплантатов. В случае тестирования взаимодействия между двумя такими факторами, как избыточная экспрессия кДНК одного фактора повторноscue ShRNA-обусловленный нокдаун еще один фактор, всегда следует включать только нокдаун трансплантатов проявляться потерей функции результат в каждом эксперименте. Это обеспечит необходимый диапазон, чтобы определить, как конкретный ген возмущает регенерация волос путем фолликула и, как два гены взаимодействуют. Удаление камеры (рис. 2A) должно быть сделано с большой осторожностью. Вновь образованный трансплантата должна быть слегка матовой с тупой поверхностью (рис. 2В). Трансплантат может прилипнуть к камере, так что осторожно приподнимая одной стороне важно убедиться, что трансплантат остается прикрепленной к ране кровати. Трансплантата является достаточно стабильным после трех дней должны представить без особого труда при снятии повязки. Устойчивый рост волос следует соблюдать в течение трех недель (рис. 2). Опуская либо Главгосслужбы или KCs приведет к восстановился раны без волос (рис. 2D) 11. Клеточную смерть или потерю клеток в одной изтипы клеток, также не приводит к волосам, в отличие от пониженной регенерации волоса в кожном-Smo нокдаун, как показано на рисунке 1b. Для успешного анализа, важно достичь более чем 90% вирусная инфекция клеток с соответствующими гиперэкспрессией или нокдаун эффективности перед прививкой. В связи с нехваткой времени на процедуру прививки, мы рекомендуем устранения неисправностей вирусной инфекции эффективность, прежде чем начать прививки эксперимент, и всегда сохранять небольшую часть клеток в день прививки процедуру для проверки потерь или усиления из-выражения. Lentiviral титр будет варьироваться в зависимости от построим используются и должны быть определены до заражения достичь 90-100% эффективности. Мы отслеживаем эффективность вирусных инфекций с GFP экспрессируются с лентивирусов вектор. Мы регулярно выполнять количественный ПЦР и / или Вестерн-блот для определения степени нокдаун или избыточная экспрессия. Использование двойного векторов экспрессии с флуоресцентных меток для маркировкиинфицированных вирусом клеток дает возможность представить perdurance сигнала и количество клеток, экспрессирующих наших конструкций в зрелом трансплантатов. Мы используем GFP обусловлено ЦМВ промотора из лентивирусов вектор pSicoR-CMV-GFP 10 в сочетании с Smo ShRNA. На рисунке 3 показано, 3-недельных кожного трансплантата конкретной где GFP в lentivirally выраженные в кожных сосочков представителя волосяной фолликул. Рисунок 1. Гистологический анализ роста волос фолликула. (A) Вид контроля трансплантата регенерации волос с кожных клеток, инфицированных пустые лентивирусов вектор и необработанных кератиноцитов. (B) Smoothened нокдаун использованием лентивирусов ShRNA в кожные клетки в сочетании с необработанным результатам кератиноциты к потере волосяного фолликула. (C) гематоксилином и эозином показывает анагена волосы Follicles в управлении трансплантаты проходят вниз в дерму и (D) Smoothened фолликулы волос остаются нокдаун в росте и в основном отсутствуют. Все изображения через три недели после прививки. Масштаб черта обозначает 100 мкм. Рисунок 2. Прививка первичных клеток. (A) Nu / Nu мыши с зашивается камере первичного жилья кожных клеток и кератиноцитов. (B) удаление камеры выставляет вновь образованных кожи, которая скучна и непрозрачный характер. (C) Полностью выросли волосы на трансплантат использования диких Введите первичных кожных клеток и кератиноцитов через три недели после прививки. (D) Добавление первичных кожных клеток кератиноцитов, не приводит ни к каким волосам через три недели. Похожие результаты наблюдаются с добавлением первичных кератиноцитов без кожных клеток. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-Страница = "Всегда"> Рисунок 3. Поддержание GFP выражение в кожных сосочков. Конфокальной изображения кожных сосочков от 3-недельных регенерированного лоскута. GFP была выражена в кожной популяции клеток из лентивирусов вектор и обнаружил в кожных сосочков (зеленый). Versican (красный) разграничивает кожных сосочков и ядер были этикетки с Hoechst (синий). Примечание GFP выражается в частности в кожных клетках, но не в окружающих кератиноцитов. Масштаб черта обозначает 20 мкм.
Discussion
Анализы волос восстановление обеспечивают уникальную модель регенерации органа для изучения механизма De Novo формирования волосяного фолликула. Здесь мы описываем изменения Пробирной палаты волос полезно для определения функции генов в волосах формирование фолликула. Наш анализ основан на камеру сообщили волос восстановление анализа 5, 6,11, который мы модифицировали ввести лентивирусные технику выражения для достижения гиперэкспрессией гена или нокдаун в любой кожной или эпидермальный типов клеток. Наш анализ обеспечивает быструю альтернативу генерации тканей специфических генетических нокаутом. Этот анализ позволяет нам демонстрировать функции генов в волосяной фолликул образование в качестве лишь три недели от заражения первичных клеток с лентивирус привить коллекции. Наш анализ может быть продлен по решению генетических взаимодействий с использованием комбинации ShRNA / кДНК доставки лентивирус в одну ячейку типа 12, а также позволяет исследовать сигнализации между дермальных и эпидермальных ячейки типES.
Наши волосы анализа лучше всего подходит для обнаружения сильных фенотипов усиления или потерей функции в регенерации волос фолликула, в то время как тонкие дефекты труднее наблюдать. Мы успешно продемонстрировали кожной специфической функции гена нескольких генов с помощью наших волос регенерации анализа 1,12. На основании маркера GFP совместно выразил от лентивирусов вектор выразить ShRNA 10, мы показали, что ShRNA выражения доноров кожных клеток сохраняется в регенерировать трансплантатов волос. GFP-положительных клеток присутствовали в кожных сосочков (DP) регенерированных волосяных фолликулов (рис. 3). DP клеток вероятно, состояла из различных уровней генной нокдаун как клетки выразили различные уровни GFP, таким образом, наблюдаемый фенотип волосяной фолликул был в диапазоне от генетических hypomorph к нулю.
Одним из улучшений для этого анализа будет заключаться в создании быстрого и эффективного отбора на высокие ShRNA клеток, экспрессирующих до graftinг такие, как использование FACS для очистки сильных GFP-экспрессирующих клеток. В качестве альтернативы можно заменить мутантным клеткам или условный нокаут в этом тесте 9. С другой стороны, культура система, которая может сохранить DP клетки функция очень полезна, так как DP потенция постепенно теряется, как только первичные кожные клетки пересевать. Потенциальные системы культуры включают в себя использование биоматериалов, полученных от искусственных нишу или агрегации культур 2,7,8,13. Еще одно улучшение будет генерировать надежные эпидермальный методом холодной камере с высокой скоростью восстановления клетки, так как это позволит снизить использование второго набора мышь щенков (шаг 7), чтобы генерировать свежие кератиноцитов в кожно-удельных потерь или усиления из- Функция исследований.
Это Пробирной палаты волос производит плотность волос фолликула и качеству похожи на нормальную кожу мыши, хотя рост волос немного меньше, синхронизированы и фолликул ориентации более случайным. Несколько ограничений регенерации волос генетический анализ в том числее требование большого количества лентивирус и сотовые номера, и это очень трудоемкий с точки зрения хирургических методов по сравнению с другими формами восстановления волос анализов, таких как патч и лоскут анализы 3,4,14. Тем не менее, качество волосяного фолликула и сроки для выявления роста волос превосходит другие анализы 4. Наш целевой анализ волос регенерации обеспечивает быстрый и удобный компаньон для существующих генетических моделей.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH АЯРБ 1F32CA14208701 (SXA) и NIH гранты AR052785 и AR046786 (AEO и В. МВт).
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comments |
| PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
| AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
| AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | |
| Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
| Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
| Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
| Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
| 70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
| 15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
| 23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
| Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
| Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
| Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
| Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
| Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
| Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
| Materials | |||
|
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Collagenase solution 0.25% (w/v) Collagenase, Type 1 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin 2.5 μg/ml Fungizone 50 μg/ml Gentamycin Polybrene solution HBSS |
References
- Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling. Dev Cell. 19, 270-283 (2010).
- Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).
- Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).
- Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution. Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).
- Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice. J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
- Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction. Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).
- Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev. 22, 543-557 (2008).
- Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).
- Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).
- Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).
- Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration. Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).
- Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells. J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).
Tags
Genetic AnalysisEpithelial-mesenchymal SignalingHair RegenerationHair Follicle MorphogenesisOrgan DevelopmentLentivirusOverexpressionShRNA-mediated KnockdownGain-of-function AnalysisLoss-of-function AnalysisPrimary Mouse KeratinocytesDermal CellsDermal Papilla CellsHair FolliclesNude MiceGenetic Models
Cite This Article
Woo, W., Atwood, S. X., Zhen, H. H., Oro, A. E. Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration. J. Vis. Exp. (72), e4344, doi:10.3791/4344 (2013).