Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

1. Bereid 0 tot 2 dagen oud pasgeboren muizen voor Skin Dissection Euthanaseren muis pups met een CO 2 kamer gedurende ten minste 20 minuten. Laat pups op ijs tot een uur tot dissectie. P0-P2 muizen zijn zeer aan te bevelen als cellen bereid uit oudere muizen een verminderde progenitor capaciteit die leidt tot lagere transplantaat opbrengsten. Bereid een schotel van 70% ethanol (voor stap 1.3) en drie schotels van wasoplossing (voor stap 3) wanneer u klaar bent voor de huid dissectie uit te voeren. Ontdooi Dispase Solution en laat het bij 4 ° C. Cervicale ontwrichten pups na CO 2 te lange blootstelling aan euthanasie te garanderen. Plaats euthanized pups in een cultuur schotel op ijs en overbrengen in een steriele zuurkast. Was pups door kort onder te dompelen in 70% ethanol en plaats op steriele cultuur schotel. 2. Ontleden Mouse Huid Afgesneden alle ledematen en staart aan de basis van de romp met een steriele schaar. Stevig vast lichaam tussen een paar cuGraco behoudt pincet en maak een incisie langs de dorsale huid van kop tot staart met behulp van een scalpel, zonder het penetreren van de onderliggende fascia. Zorgvuldig verwijderen van de huid uit de buurt van de middellijn van de muis. Stevig vastpakken van de blootgestelde muis met de lange zijde van de gekromde forceps en plaats een ander paar gebogen forceps onder de huid aan het achterste uiteinde van de muis huid voorzichtig stoppen heupen naar de ventrale helft van de muis. Verwijder voorzichtig de huid helemaal van de muis in een vloeiende beweging en gooi het karkas. 3. Was de huid en het Incubate met Dispase Solution Plaats de huid in de eerste schotel van wasoplossing met dermis naar beneden. Spreid de huid uit en schud met een pincet. Laat de huid in de eerste schotel van wasoplossing terwijl het ontleden van de volgende huid. Na het plaatsen van de volgende ontleed huid in de eerste schotel van wasoplossing, de overdracht van de voorafgaande huid aan de tweede schotel van wasoplossing. Houd skins in the seconde wasoplossing totdat alle huiden worden verzameld. Breng alle van de huiden van de laatste wasbeurt, kort schudden. Voeg 10 ml ijskoud Dispase naar een steriele 10 cm cultuur schotel. Overdracht huid om de Dispase Solution en plat huid dermis naar beneden. Zweven huid gedurende 8-16 uur bij 4 ° C (alternatief: 1 uur bij 37 ° C). 4. Aparte dermis en epidermis Overdracht huid om een ​​nieuwe steriele cultuur schotel en plat huid dermis naar beneden. Voorzichtig houd de dermis van de ene hoek met een scalpel. Pak de epidermis met een tang en langzaam loskomen van de dermis. Epidermis moet afpellen als een stuk. De epidermis is wit en dun en de dermis moet bruinachtig, dikker, en gelatineachtige. Scheid de twee weefsels in afzonderlijke steriele cultuur gerechten. Om een ​​dermale specifiek gen knockdown / overexpressie graft te maken, neem dermis en gehakt in heel kleine stukjes met two scalpels. Gooi epidermis. Op dag van infectie (stap 7), ontleden andere set muizen vellen aan verse onbehandelde epidermale cellen te combineren met lentivirale geïnfecteerde dermale cellen. Om een ​​epidermale specifiek gen knockdown / overexpressie graft te maken, snijd elk opperhuid in 6 tot 8 kleinere stukken. Gooi dermis. Op dag van infectie (stap 7), ontleden andere set muizen vellen aan verse onbehandelde huid cellen te combineren met lentivirale geïnfecteerde epidermale cellen. 5. Distantiëren Primaire Muis Dermaal Cells (MDCs) van gehakt Tissue Dissociëren MDCs door incubatie dermale stukken met verse collagenaseoplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur. Gebruik 10 ml collagenase oplossing per muis pup. Voorzichtig mengen oplossing die dermis om de 10 minuten. Controleer de mate van dissociatie onder een microscoop, de verkregen celsuspensie moet meestal enkele cellen. De oplossing moet veranderen van helder tot bewolkt zodermale cellen worden gescheiden van de dermis. Toevoegen aan FBS collagenaseoplossing met dermis met 10% eindvolume de activiteit van collagenase verminderen. Steek de celsuspensie door middel van een 70 pm cel zeef in een nieuwe 50 ml buis tot grote onverteerde massa's en hele follikels te verwijderen. Voeg 10 ml DMEM/10% FBS per 30 ml van de doorloop verder verdunnen collagenase. Centrifuge buizen die verteerd dermis bij 30 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten om verder te verwijderen hele follikels. Breng voorzichtig de supernatant naar een nieuwe 50 ml tube. Pellet cellen door centrifugeren bij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen met DMEM/10% FBS (1 ml per pup) en tel cellen. Cellaag met AmnioMax C-100 media voor infectie (stap 7), of combineren met lentivirus geïnfecteerde KC voor enting (stap 9). Typische opbrengst is 20 x 10 6 cellen per pup. 6. Distantiëren Primaire keratinocytens (KC) van gehakt Tissue Dissociëren KC door incubatie epidermale stukken met vers ontdooid 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Gebruik 7 ml trypsine-EDTA per muis pup. Zwenk oplossing die epidermis om de 5 minuten. Voeg gelijke volume van neutraliserende oplossing aan trypsine-EDTA bevattende epidermis de activiteit van trypsine verminderen. Pellet cellen door centrifugeren bij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. Resterende onverteerd weefsel moet drijven op de top. Giet het grootste deel van het supernatant met onverteerd weefsel. Resterende supernatant met een pipet 10 ml zonder storende cel pellet. Resuspendeer celpellet met PBS. Bij KCS niet volledig gepelleteerd, giet meeste supernatant en herhaal centrifugeren tot de meeste cellen gepelleteerd. Zeef celsuspensie door middel van 70 pm cel zeef in een nieuwe buis om de resterende weefsel of klonten te verwijderen. Pellet cellen door centrifugerenbij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in CNT-07 media of PBS (1 ml per pup) en tellen cellen. Gebruik CNT-07 voor plating cellen voor infectie (stap 7), met PBS om met lentivirus geïnfecteerde MDCs combineren enting (stap 9). Typische opbrengst 3-10 is x 10 6 cellen per pup. 7. Infect primaire cellen met Lentivirus met een gehalte shRNA of cDNA Op dag van infectie ontleden andere reeks muis vellen aan verse onbehandelde primaire KCS of MDCs te combineren met virus geïnfecteerde cellen op dag van enting (stap 9) te bereiden. Voor MDCs, plaat 4 x 10 6 MDCs per 10 cm plaat met AmnioMax-C100 media en incubeer bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende volgende dag infectie bij 50% celdichtheid. Gewoonlijk 3-4 platen MDCs worden gebruikt om een ​​ent genereren, en een totaal van 10-12 platen nodig om drie grafts in een experiment genereren. Als alternatief, laat MDCs hechten en verspreiden fof minimaal 2 uur bij 37 ° C + 5% CO2 en infectie dezelfde dag van cel plating voeren. MDCs zal fibroblast-achtige morfologie. Voor KC, plaat 12 x 10 6 KC per 10-cm plaat met CNT-07 media en incubeer bij 37 ° C + 5% CO 2 voor de volgende dag infectie. Alternatief laat KC hechten en minimaal 2 uur uitgezaaid op 37 ° C + 5% CO2 en infectie op dezelfde dag voeren. Gewoonlijk 3-4 KC platen worden gebruikt om een ​​ent genereren. Een totaal van 10-12 platen nodig om drie grafts voor een experiment genereren. KCS zal geplaveide morfologie. Preincubate cellen gedurende 5-10 minuten met 8 pg / ml Polybreen oplossing bij 37 ° C + 5% CO2. Uitwisselingsmedia en voeg lentivirus + 8 ug / ml Polybreen Solution. Lentivirale titer afhankelijk van het construct gebruikt en moeten vóór infectie. Centrifugeer de platen bij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 1 uur bij 32 °; C om cellen te infecteren met lentivirus. Verwijder lentivirus-bevattende media en voeg vers medium. Voor KC, een keer wassen cellen met PBS voor het toevoegen van weer nieuwe media. Meestal geïnfecteerde cellen herstellen nacht bij 37 ° C + 5% CO2. Alternatief ten minste twee uur van terugwinning bij 37 ° C + 5% CO2 voordat trypsinizing de cellen grafts. Blijven cultuur een klein gedeelte van geïnfecteerde cellen op infecties efficiëntie zoals beschreven in de sectie Representatieve resultaten. 8. Bereid geïnfecteerde cellen voor enting Isoleer verse primaire MDCs of KCS van de huid met behulp van de stappen 4-6. Resuspendeer cellen in ijskoude steriele PBS. Tellen cellen. Voor dermale specifiek gen knockdown / overexpressie graft, dissociëren geïnfecteerde MDCs van platen met 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 8 min. Voor epidermale specifiek gen knockdown / overexpressie graft, dissociëren geïnfecteerde KC platen van using 0,125% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Neutraliseren trypsine activiteit met DMEM + 10% FBS (MDCs) of neutraliserende oplossing (KC). Breng de getrypsiniseerde cellen in een 50 ml buis. Pellet cellen door centrifugeren bij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in ijskoude steriele PBS. Tellen cellen. Combineer de virus-geïnfecteerde cellen met de vers bereide onbehandelde tegenhanger celtype. Voor een graft te combineren 7-10 x 10 6 MDCs Met 7-10 x 10 6 KCS in ijskoud steriel PBS en de cel pellet slurry in een tafelblad centrifuge bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 50 -100 ul ijskoude steriele PBS. Houd cellen op ijs tot nu / nu muizen kamers klaar zijn. 9. Maak Wond Bed and Fix Kamer op Terug van nu / nu Muis Een dag voor het enten, steriliseren chirurgische instrumenten met autoclaaf en steriele silicium kamers door het weken in 70% ethanol. Vervang de 70% Ethanol met steriel PBS voordat u de kamers. Anesthetize nu / nu muizen (7-12 weken oud vrouwtjes) met ketamine (8 mg / ml) / xylazine (1,6 mg / ml) via intraperitoneale injectie (100 μl/10 g lichaamsgewicht) of andere voorkeur. Breng oog smeermiddel. Plaats verwarmingselement onder de muis. Desinfecteer naakt muis terug huid met jodium en schoon met alcoholdoekjes. Voeg 1-3 druppels 0,25% tot Bupivicaine incisie topisch. Knijp het naakt muis terug de huid aan de basis van de nek met een pincet. Snij een klein rond gat (~ 1 cm in diameter) in huidplooi met een steriele schaar. Plaats steriele kamer op wondbed en bedek kamer randen met de omliggende huid. Beveiligde ruimte plaats met hechtingen langs randen kamer (6 steken per kamer) zoals getoond in figuur 2A. Wanneer kamers klaar zijn, voorzichtig werveling cel slurry en stelt in 23 gauge naald grenst aan 1 ml spuit. Als cel drijfmest gecondenseerd onder voorzichtigresuspendeer met 1 ml pipet tip voor het opzuigen in de naald. Prik kamer met naald en langzaam cellen druppelen wond. Plaats muizen in schone, geautoclaveerd kooien. Huis 2 muizen per kooi en antibiotica en Tylenol (3 mg / ml) tot drinkwater voegen. In onze ervaring, hebben twee vrouwelijke muizen per kooi niet geleid tot ongunstige trauma aan de kamer, transplantaat, of dieren. Plaats verwarmingskussen minder dan de helft van de kooi en observeer muizen tot verdoving is uitgewerkt. 10. Verwijder Kamer Na 7-9 dagen Verdoof chambered nu / nu muizen als in stap 9.1. Breng oog smeermiddel. Desinfecteer de huid rond de kamer met jodium en schoon met alcoholdoekjes. Knip voorzichtig steken en te verwijderen uit de kamer. Verwijder voorzichtig de kamer van muis. Als er nieuwe huidtransplantatie stokken naar de kamer, tilt een deel van de kamer en voorzichtig gescheiden transplantaat uit de kamer met behulp van een tang. Houd graft naar beneden tijdens het verwijderen van de kamer. Graft moet look dof en ondoorzichtig als in figuur 2B. Breng een niet-hechtende pad met een dunne film van antibiotica op de open wond en hechting plaats (2 st). Wikkel verband rond de muis om de pad te beveiligen en de wond te beschermen. Hecht bandage op zijn plaats. De silicium kamers worden gereinigd door wassen met zeep en grondig gespoeld met gedeïoniseerd water. Week de kamers in 70% ethanol 's nachts, drogen aan de lucht, en op te slaan. 11. Onderzoek Muis voor haargroei Verwijder verbandmiddelen en pad na 3 dagen van de kamer verwijderen. Graft moet droog en ondoorzichtig tot bruin van kleur. Controleer regelmatig muizen voor de haargroei. Haar moet beginnen om te laten zien op 16 dagen na de transplantatie. Procedure Outline Dag 1 (2-3 uur): Sacrifice pasgeboren pups, verwijder de huid, en laat op dispase bij 4 ° C gedurende de nacht. Dag 2 (2-3 uur): Isoleer primaire cellen van de huid enplaat bij de aanbevolen celdichtheid. Dag 3 (3-4 uur) Infect cellen met lentivirus. Verwijder het vel van een set van pasgeboren pups en vertrekken dispase bij 4 ° C overnacht. Dag 4 (6-8 uur): Isoleer primaire cellen van de huid, tellen, en laat op ijs. Herstel lentivirus geïnfecteerde cellen door trypsinisatie en centrifugeren, tellen en combineren 7-10 x 10 6 huidcellen en keratinocyten in 50-100 pi PBS per graft. Maak wondbed op de muis, hechten kamer, en van toepassing celmengsel naar bed gewikkeld. Alternatieve procedure wordt beschreven Alternatieve procedure hoofdlijnen verkort de procedure van vier dagen tot drie. Combineer dag 1 en dag 2 door behandeling muis achtergronden in dispase bij 37 ° C gedurende een uur (verwachte 5-7 uur). Combineer dag 2 en dag 3 door cellen met lentivirus na uitplaten cellen gedurende twee uur (geschatte tijd 5-7 uur).