تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر
Summary
الأنسجة محددة تحليل لتجديد بصيلات الشعر باستخدام نموذج الفيروسة البطيئة للتوسط ربح أو خسارة وظيفة.
Abstract
الشعر جريب التشكل، وهي عملية معقدة تتطلب التفاعل بين الخلايا القرنية المستمدة من ظهائر واللحمة المتوسطة الكامنة، هو نظام نموذج جذاب لدراسة تطوير الجهاز والأنسجة إشارات محددة. على الرغم من أن الشعر هو الجريب التنمية لين العريكة وراثيا، وتحليل سريع وقابلة للتكرار من العوامل الأساسية لهذه العملية لا يزال يمثل تحديا. نحن هنا وصف الإجراء لتوليد overexpression استهدفت shRNA أو بوساطة ضربة قاضية من العوامل باستخدام الفيروسة البطيئة بطريقة الأنسجة محددة. باستخدام نسخة معدلة من نموذج تجديد الشعر 5، 6، 11، يمكننا تحقيق مكاسب أو خسائر قوية من بين الخلايا الكيراتينية وظيفة تحليل في الماوس الأولية أو الخلايا الجلدية لتسهيل دراسة الظهارية-الوسيطة مسارات الإشارات التي تؤدي إلى التشكل بصيلات الشعر . ونحن تصف كيفية عزل الخلايا القرنية الطازجة الماوس الابتدائية وخلايا الجلد، والتي تحتوي على خلايا الجلد حليمة وسلائفها، وتقديم الفيروسة البطيئة CONTAIنينغ إما shRNA أو [كدنا] إلى واحدة من السكان الخلية، والجمع بين الخلايا لتوليد بصيلات الشعر تشكيلها بالكامل على ظهور الفئران عارية. هذا النهج يتيح تحليل الأنسجة محددة العوامل المطلوبة لتوليد بصيلات الشعر في غضون ثلاثة أسابيع، ويوفر مرافق سريعة ومريحة لنماذج الوراثية الموجودة.
Protocol
1. إعداد 0-2 أيام الفئران حديثي الولادة قديم لتشريح الجلد الموت ببطء الجراء باستخدام الماوس CO 2 غرفة لا يقل عن 20 دقيقة. ترك الجراء على الجليد يصل إلى ساعة حتى تشريح. ويوصى بشدة P0-P2 الفئران وخلايا المعدة من أقدم الفئران قد خفضت القدرة السلف في ذلك من عوائد أقل الكسب غير المشروع. إعداد طبق واحد من الإيثانول 70٪ (على الخطوة 1.3) وثلاثة أطباق من حل غسيل (لخطوة 3) عندما تصبح مستعدة لأداء تشريح الجلد. ذوبان الجليد الحل Dispase ونترك الامر عند 4 درجات مئوية. عنق الرحم خلخل الجراء بعد التعرض المفرط 2 CO لضمان القتل الرحيم. وضع الجراء الموت الرحيم في صحن الثقافة على الجليد ونقل إلى غطاء تدفق العقيمة. غسل الجراء عن طريق غمر لفترة وجيزة في الايثانول 70٪ ومكان على طبق الثقافة العقيمة. 2. تشريح الجلد ماوس قطع كل الأطراف والذيل عند قاعدة الجذع مع مقص العقيمة. فهم الجسم بقوة بين زوج من النحاسrved ملقط وجعل شق الجلد على طول الظهرية من الرأس الى الذيل باستخدام مشرط دون اختراق اللفافة الأساسية. قشر الجلد بعناية بعيدا عن خط الوسط من الفأرة. فهم يتعرضون الماوس بحزم مع الجانب طويلة من ملقط المنحني وإدراج آخر زوج من ملقط المنحني تحت الجلد في نهاية الخلفي من الماوس وسحب بلطف الجلد فوق الوركين نحو النصف البطنية من الفأرة. قشر الجلد بعناية تماما قبالة الماوس في اقتراح واحد على نحو سلس وتجاهل الذبيحة. 3. يراعى غسل البشرة واحتضان مع الحل Dispase وضع الجلد في الطبق الأول من الحل غسيل مع الجانب الأدمة أسفل. نشر من الجلد وتستنهض الهمم مع ملقط. ترك الجلد في الطبق الأول من الحل غسل الجلد أثناء تشريح المقبل. بعد وضع الجلد تشريح المقبل في أول طبق من حل يغسل، ونقل الجلد قبل الطبق الثاني من الحل يغسل. الحفاظ على الجلود في اله غسل الحل الثاني حتى يتم جمع جميع الجلود. نقل كل من الجلود إلى غسل النهائي، تستنهض الهمم لفترة وجيزة. إضافة 10 مل Dispase الجليد الباردة المعقمة إلى 10 سم طبق الثقافة. نقل الجلد إلى الحل Dispase وتتسطح الجلد الأدمة الجانب السلبي. تطفو الجلد ل8-16 ساعة في 4 درجات مئوية (الخيار البديل: 1 ساعة عند 37 ° C). 4. الأدمة والبشرة منفصلة نقل الجلد إلى طبق الثقافة العقيمة جديدة وتتسطح الجلد الأدمة الجانب السلبي. بعناية باستمرار الأدمة من زاوية واحدة مع مشرط. فهم البشرة مع ملقط وببطء قشر بعيدا عن الأدمة. ينبغي البشرة قشر بعيدا عن قطعة واحدة. سوف تكون بيضاء البشرة والأدمة رقيقة وينبغي أن يكون اللون البني، سمكا، وهلامي. فصل الأنسجة منفصلة اثنين الى الأطباق الثقافة العقيمة. لجعل الجلد محددة الجينات ضربة قاضية / overexpression الكسب غير المشروع، واتخاذ الأدمة واللحم المفروم إلى قطع صغيرة جدا مع رالمشارط التعليم الجامعي. تجاهل البشرة. في يوم من العدوى (الخطوة 7)، تشريح مجموعة أخرى من جلود الماوس للتحضير، دون علاج جديدة للجمع بين خلايا البشرة مع lentiviral المصابين خلايا الجلد. لجعل البشرة محددة الجينات ضربة قاضية / overexpression الكسب غير المشروع، كل شريحة البشرة في 6 حتي 8 أجزاء أصغر. تجاهل الأدمة. في يوم من العدوى (الخطوة 7)، تشريح مجموعة أخرى من جلود الماوس للتحضير، دون علاج جديدة للجمع بين الخلايا الجلدية مع lentiviral المصابين خلايا البشرة. 5. فصل خلايا فأر الأولية عن طريق الجلد (mDCs) من الأنسجة مفروم فصل mDCs من احتضان قطعة الجلد مع حلول كولاجيناز الطازجة في C ° 37 لمدة 1 ساعة. استخدام 10 مل من محلول كولاجيناز في الماوس الجرو. المزيج بلطف الأدمة محلول يحتوي على كل 10 دقيقة. التحقق من مدى التفكك تحت المجهر، والتعليق الخلية يجب أن تكون الخلايا هضمها واحدة في الغالب. يجب أن الحل واضح من تغيير إلى غائم كماالخلايا الجلدية هي فصل من الأدمة. إضافة إلى FBS الحل كولاجيناز تحتوي الأدمة على حجم نهائي 10٪ للحد من نشاط كولاجيناز. تمرير التعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر في أنبوب جديد 50 مل لإزالة عسر الهضم وكتل كبيرة بصيلات كله. إضافة 10 مل من FBS DMEM/10٪ في 30 مل من التدفق من خلال زيادة لتخفيف كولاجيناز. أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي الأدمة هضمها في 30 XG على الطاولة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق لإزالة المزيد من بصيلات كله. نقل بعناية طاف لأنبوب جديد 50 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 XG على الطاولة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا مع FBS DMEM/10٪ (1 مل لكل الجرو) والاعتماد الخلايا. لوحة الخلايا مع وسائل الاعلام Amniomax C-100 للعدوى (الخطوة 7)، أو الجمع مع الفيروسة البطيئة المصابين KC للتطعيم (الخطوة 9). العائد النموذجي هو 20 × 10 6 خلايا في الجرو. 6. فصل خلية كيراتينية الابتدائيةق (KC) من الأنسجة مفروم فصل KC من احتضان قطعة البشرة مع 0.05٪ التربسين إذابة طازجة-EDTA في C ° 37 لمدة 15 دقيقة. استخدام 7 مل من التربسين EDTA-الماوس في الجرو. الحل بلطف دوامة تحتوي على البشرة كل 5 دقائق. إضافة حجم مساو من الحل لتحييد التربسين EDTA-البشرة المحتوية للحد من نشاط التربسين. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 XG على الطاولة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. يجب أن تبقى الأنسجة غير مهضوم تطفو على السطح. صب بعناية قبالة معظم الأنسجة طاف مع عسر الهضم. إزالة طاف مع ماصة المتبقية 10 مل من دون بيليه الخلية مثيرة للقلق. إعادة تعليق بيليه الخلية مع PBS. في حالة KCS ليست مكعبات تماما، صب قبالة معظم طاف وكرر الطرد المركزي حتى معظم الخلايا مكعبات. توتر التعليق الخلية الى 70 ميكرومتر مصفاة الخلية في أنبوب جديد لإزالة الأنسجة المتبقية أو كتل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزيفي 200 XG على الطاولة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في المركز الوطني للاستشعار-07 أو وسائل الإعلام PBS (1 مل لكل الجرو) وخلايا العد. استخدام ورق-07 للخلايا الطلاء للعدوى (الخطوة 7)، استخدم PBS إندماج مع الفيروسة البطيئة المصابين mDCs لتطعيم (الخطوة 9). العائد نموذجي هو 3-10 × 10 6 خلايا في الجرو. 7. تصيب الخلايا الأولية مع الفيروسة البطيئة أو يحتوي على shRNA [كدنا] في يوم من العدوى تشريح مجموعة أخرى من جلود الماوس للتحضير، غير المعالجة الأولية الطازجة أو KCS mDCs لتتحد مع الخلايا المصابة بالفيروسات في يوم من التطعيم (الخطوة 9). لmDCs، لوحة 4 × 10 6 mDCs بنسبة 10 سم، مع لوحة AmnioMAX-C100 وسائل الإعلام واحتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2 للعدوى في اليوم التالي كثافة الخلية 50٪. وتستخدم عادة لوحات 3-4 من mDCs لإنشاء إحدى الكسب غير المشروع، وهناك حاجة إلى ما مجموعه من 10-12 لوحات لتوليد ثلاثة الطعوم في تجربة واحدة. بدلا من ذلك، دعونا نعلق mDCs ونشر وأو على الأقل من 2 ساعة في 37 ° C + CO 2 و 5٪ أداء العدوى في نفس اليوم من الطلاء الخلية. وسوف يكون mDCs تشبه الخلايا الليفية التشكل. لKC، لوحة 12 × 10 6 10-KC في الطول مع وسائل الاعلام لوحة-07 ارق واحتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2 للعدوى اليوم التالي. بدلا من ذلك، دعونا نعلق KC وتنتشر مدة لا تقل عن 2 ساعة عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2 و أداء العدوى في نفس اليوم. وتستخدم عادة لوحات 3-4 من KC لإنشاء إحدى الكسب غير المشروع. وهناك حاجة إلى ما مجموعه من 10-12 لوحات لتوليد ثلاثة ترقيع لتجربة واحدة. وسوف يكون KCS التشكل المرصوفة بالحصى. يحضن مسبقا لخلايا 5-10 دقيقة مع 8 ميكروغرام / مل الحل Polybrene في 37 ° C + 5٪ CO 2. التبادل الإعلامي وإضافة الفيروسة البطيئة + 8 ميكروغرام / مل الحل Polybrene. سوف عيار Lentiviral تختلف تبعا لاستخدامها وبناء ينبغي أن تحدد قبل الإصابة. أجهزة الطرد المركزي لوحات في 200 XG على الطاولة الطرد المركزي لمدة 1 ساعة عند 32 °؛ C لتصيب الخلايا مع الفيروسة البطيئة. إزالة الفيروسة البطيئة التي تحتوي على وسائل الإعلام وسائل الإعلام إضافة جديدة. لKC، وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة وسائل الإعلام مرة أخرى جديدة. الخلايا المصابة عادة استرداد بين عشية وضحاها في 37 درجة C + 5٪ CO 2. بدلا من ذلك، تسمح على الأقل ساعتين من الانتعاش في 37 ° C + 5٪ CO 2 قبل trypsinizing الخلايا لترقيع. تواصل الثقافة جزء صغير من الخلايا المصابة للتأكد من كفاءة العدوى كما هو موضح في المقطع ممثل النتائج. 8. إعداد الخلايا المصابة لتطعيم عزل mDCs الأولية الطازجة أو KCS من الجلد باستخدام الخطوات 4-6. إعادة تعليق الخلايا في معقمة PBS الجليد الباردة. عد الخلايا. لالجلدي محددة الكسب غير المشروع ضربة قاضية / overexpression الجينات، فصل mDCs المصابة من لوحات باستخدام 0.05٪ التربسين EDTA-C ° 37 في 8 دقائق ل. لالبشرة محددة الكسب غير المشروع ضربة قاضية / overexpression الجينات، فصل KC المصابة من لوحات USIنانوغرام 0.125٪ التربسين EDTA-في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تحييد التربسين النشاط باستخدام DMEM FBS + 10٪ (mDCs) أو تحييد الحل (KC). نقل الخلايا إلى أنبوب trypsinized 50 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 XG على الطاولة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في معقمة PBS الجليد الباردة. عد الخلايا. الجمع بين الخلايا المصابة بالفيروسات مع الطازجة غير المعالجة نظيره نوع من الخلايا. الكسب غير المشروع لأحد، والجمع بين 7-10 × 10 6 mDCs مع 7-10 KCS X 6 10 العقيمة في الجليد الباردة PBS بيليه والطين خلية في جهاز للطرد المركزي في الطاولة C. ° 4 إعادة تعليق الخلايا في 50 -100 ميكرولتر الجليد الباردة PBS العقيمة. تبقي الخلايا على الجليد حتى نو / نو غرف الماوس جاهزة. 9. إنشاء غرفة سرير الجرح والإصلاح إلى العودة من نيو / نو ماوس وقبل يوم من التطعيم، تعقيم الأدوات الجراحية الأوتوكلاف مع الغرف السيليكون ومعقمة عن طريق نقع في الايثانول 70٪. استبدال 70٪ ethaNOL مع PBS معقمة قبل استخدام الدوائر. تخدير نو / نو الماوس (7-12 أسبوع من العمر الإناث) باستخدام الكيتامين (8 ملغ / مل) / زيلازين (1.6 ملغ / مل) عن طريق الحقن داخل الصفاق (100 ز μl/10 الجسم الوزن) أو الأسلوب المفضل الأخرى. تطبيق مواد التشحيم العين. المكان سادة التدفئة تحت الماوس. تطهير الجلد عارية الظهر الفأر مع اليود ومسحات الكحول مع تنظيف. إضافة 1-3 قطرات Bupivicaine 0.25٪ لموقع شق موضعيا. قرصة الجزء الخلفي الماوس عارية الجلد في قاعدة العنق مع ملقط. قطع ثقب صغير دائري (~ 1 سم في القطر) في الجلد مقروص مع مقص العقيمة. وضع غرفة معقمة على الجرح والسرير تغطية حواف الدائرة المحيطة مع الجلد. غرفة آمنة في مكان الغرز على طول الحواف مع غرفة (6 غرز في الغرفة) كما هو موضح في الشكل 2A. عندما غرف جاهزة، خلية دوامة الطين برفق ووضع إبرة قياس 23 إلى تعلق على حقنة 1 مل. إذا تكثفت الطين في أسفل الخلية، بلطفإعادة تعليق تلميح ماصة مع 1 مل قبل الرسم في الإبرة. غرفة ثقب إبرة مع وبالتنقيط ببطء على الخلايا الجرح. الفئران مكان في أقفاص نظيفة وتعقيمها. منزل 2 الفئران في قفص وإضافة المضادات الحيوية وتايلينول (3 ملغ / مل) على مياه الشرب. في تجربتنا، واثنين من إناث الفئران في قفص لم تؤد في مجال الصدمات النفسية السلبية إلى الدائرة، الكسب غير المشروع، أو الحيوانات. وضع وسادة تحت القفص الاحترار النصف وحتى الفئران مراقبة التخدير يلبس. 10. إزالة غرفة بعد 7-9 أيام تخدير حجرات نو / نو الماوس كما في الخطوة 9.1. تطبيق مواد التشحيم العين. تطهير الجلد حول الدائرة مع اليود ومسحات الكحول مع تنظيف. قطع بعناية وإزالة الغرز من الغرفة. إزالة بلطف غرفة من الماوس. إذا العصي جديدة الكسب غير المشروع الجلد إلى الدائرة، ورفع جزء من غرفة منفصلة والكسب غير المشروع بلطف باستخدام ملقط من غرفة. الكسب غير المشروع عقد لأسفل أثناء إزالة من الغرفة. الكسب غير المشروع ينبغي الحمامك مملة وغير شفاف كما هو الحال في الشكل 2B. تطبيق لوحة غير ملتصقة مع طبقة رقيقة من المضادات الحيوية على الجرح المفتوح وخياطة في مكانه (2 غرزة). التفاف حول ضمادة الماوس لتأمين لوحة وحماية الجرح. خياطة ضمادة في مكانها. يتم تنظيف الغرف من السيليكون مع صابون خفيف الغسل وتشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات. نقع في غرف الايثانول 70٪ بين عشية وضحاها، والهواء الجاف، ومتجر. 11. دراسة ماوس لنمو الشعر إزالة الضمادات وسادة بعد 3 أيام من إزالة غرفة. يجب أن تكون جافة والكسب غير المشروع مبهمة إلى اللون البني. تحقق الفئران بشكل دوري لنمو الشعر. يجب أن الشعر تبدأ تظهر في 16 يوما بعد الكسب غير المشروع. إجراء المخطط التفصيلي يوم 1 (2-3 ساعة): التضحية الجراء الوليد، وإزالة الجلد، وترك على dispase بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. يوم 2 (2-3 ساعة): عزل الخلايا الأولية من الجلد ولوحة في كثافة الخلايا الموصى بها. اليوم 3 (HR 3-4): تصيب الخلايا مع الفيروسة البطيئة. إزالة الجلد من مجموعة أخرى من الجراء الوليد وترك على dispase بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. يوم 4 (6-8 ساعة): عزل الخلايا الأولية من الجلد، والعد، وترك على الجليد. الفيروسة البطيئة استعادة المصابين الخلايا عن طريق الطرد المركزي وtrypsinization، عد، والجمع بين 7-10 × 10 6 خلايا الجلد الكيراتينية وإلى 50-100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الكسب غير المشروع. إنشاء سرير الجرح على الماوس، ونعلق الدائرة، وتطبيق خليط الخلية إلى جرح السرير. الإجراء البديل الخطوط العريضة والخطوط العريضة الإجراء البديل تقصير الإجراء من أربعة أيام إلى ثلاثة. الجمع بين يوم 1 ويوم 2 من جلود علاج الماوس في dispase في C ° 37 لمدة ساعة (الوقت المقدر للموارد البشرية 5-7). الجمع بين يوم 2 و 3 في اليوم مع الفيروسة البطيئة اصابة الخلايا الخلايا بعد الطلاء لمدة ساعتين (ساعة الوقت المقدر 5-7).
Representative Results
في الشكل 1 نعرض الجلد نتيجة محددة ضربة قاضية shRNA lentiviral من مملس (SMO)، وهو مكون SHH حرجة مما يشير، في الكسب غير المشروع التجديدي الشعر في 3 أسابيع من العمر. التحكم باستخدام الطعوم ناقلات lentiviral وحده تظهر قوة نمو الشعر (الشكل 1A). على النقيض من ذلك، عن طريق الجلد محددة ضربة قاضية من النتائج في فقدان بيانات التزامات العضوية نمو الشعر (1B الشكل). hematoxylin و eosin وصمة عار يصور مرحلة من بصيلات الشعر في السيطرة والظروف التجريبية (الشكل 1C، D). يمكن النمط الظاهري نمو الشعر من العلاجات مماثلة تكون متغيرة بين التجارب، بما في ذلك مكافحة العدوى الإيجابية مع ناقلات lentiviral وحدها. وينبغي دائما ترقيع مراقبة إيجابية ولذلك يتم تضمينه في كل تجربة كمرجع إلى 30٪ من الطعوم يمكن أن تفشل نتيجة لتندب أو المرفقات غير مكتملة من الطعوم. في حالة اختبار تفاعل بين اثنين من العوامل مثل overexpressing [كدنا] من عامل واحد لإعادةscue shRNA بوساطة ضربة قاضية من عامل آخر، وينبغي للمرء دائما تشمل ترقيع ضربة قاضية وحدها لإظهار نتيجة الخسارة من وظيفة في كل تجربة. هذا وسوف توفر مجموعة واللازمة لتحديد كيف يمكن لجينات معينة يشوش تجديد بصيلات الشعر وكيفية مسار اثنين من الجينات تتفاعل. ويجب أن يتم إزالة الدائرة (الشكل 2A) مع الرعاية. يجب أن تكون الكسب غير المشروع التي شكلت حديثا مبهمة قليلا مع سطح مملة (الشكل 2B). الكسب غير المشروع قد التصق إلى الدائرة، لذلك رفع بلطف جانب واحد من المهم للتأكد من أن الكسب غير المشروع لا يزال تعلق على سرير الجرح. الكسب غير المشروع هو مستقر تماما بعد ثلاثة أيام، وينبغي تقديم صعوبة تذكر عند إزالة الضمادة. ينبغي مراعاتها قوية نمو الشعر بعد ثلاثة أسابيع (الشكل 2C). وإما حذف أو mDCs KCS يؤدي في موقع الجرح للشفاء من دون أي الشعر (الشكل 2D) 11. موت الخلايا أو فقدان الخلايا في واحدة منأنواع الخلايا في النتائج أيضا لا شعر، وعلى النقيض من انخفاض في تجديد الشعر عن طريق الجلد، ضربة قاضية بيانات التزامات العضوية كما هو مبين في الشكل 1B. لضمان نجاح الفحص، فإن من الأهمية بمكان لتحقيق أكبر من 90٪ من الخلايا العدوى الفيروسية مع overexpression مناسبة أو الكفاءة ضربة قاضية قبل التطعيم. نظرا لضيق الوقت لإجراء عمليات ترقيع، نوصي مشكلة اطلاق النار الكفاءة عدوى فيروسية قبل البدء في التجربة التطعيم، وحفظ دائما جزء صغير من الخلايا في يوم من إجراء التطعيم للتحقق من مكاسب أو خسائر-التعبير. سوف عيار Lentiviral تختلف تبعا لاستخدامها وبناء ينبغي أن تحدد قبل العدوى إلى تحقيق الكفاءة 90-100٪. نحن نراقب الفيروسي العدوى كفاءة مع GFP coexpressed من ناقلات lentiviral. نقوم بشكل روتيني الكمية PCR و / أو لطخة غربية لتحديد مدى ضربة قاضية أو overexpression. استخدام مزدوج التعبير ناقلات مع العلامات الفلورية لتسميةالخلايا المصابة فيروسي يوفر وسيلة لتقرير perdurance من الإشارة وعدد الخلايا معربا عن ثوابت لدينا في ترقيع ناضجة. نستخدم GFP يقودها المروج CMV من ناقلات lentiviral pSicoR-CMV-10 في GFP بالاشتراك مع shRNA SMO. في الشكل 3، وتبين لنا خلال 3 أسابيع من العمر الجلدي محددة الكسب غير المشروع حيث يتم GFP-lentivirally أعرب في حليمة الجلد لبصيلات الشعر التمثيلي. الشكل 1. التحليل النسيجي للنمو بصيلات الشعر. (A) عرض من الشعر الكسب غير المشروع تجديد مع سيطرة الخلايا الجلدية المصابة مع ناقلات lentiviral الفارغة والخلايا الكيراتينية غير المعالجة. (B) باستخدام مملس ضربة قاضية shRNA lentiviral في خلايا الجلد الكيراتينية جنبا إلى جنب مع نتائج غير المعالجة في فقدان بصيلات الشعر. (C) وتلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين يظهر طور التنامي و الشعر ollicles في ترقيع السيطرة يمتد إلى أسفل في الأدمة و (D) مملس بصيلات الشعر وتوقف ضربة قاضية تبقى غائبة إلى حد كبير. جميع الصور هي ثلاثة أسابيع بعد التطعيم. شريط مقياس يدل 100 ميكرون. الشكل 2. تطعيم الخلايا الأولية. (A) نو / نو الفأر مع خلايا الجلد السكن غرفة خياطة الأولية والخلايا الكيراتينية. (B) الكشف عن المنشأة حديثا إزالة الجلد الذي هو غرفة مملة وغير شفافة في حرف (C) على الشعر بالكامل نمت الكسب غير المشروع باستخدام البرية اكتب خلايا الجلد الكيراتينية في الابتدائية وبعد ثلاثة أسابيع من التطعيم. (D) عن طريق الجلد من الخلايا إضافة الابتدائي دون أي الخلايا القرنية يؤدي إلى الشعر بعد ثلاثة أسابيع. وينظر نتائج مماثلة مع إضافة الكيراتينية الأولية دون الخلايا الجلدية. <p class="jove_content" fo:keep-together.withinصفحة = "دائما"> الشكل 3. صيانة التعبير GFP في الحليمة الجلدية. صور متحد البؤر من حليمة الجلد من الكسب غير المشروع القديم 3-مجدد الاسبوع. وأعرب عن GFP في خلية الجلد السكان من ناقلات lentiviral والكشف في الحليمة الأدمية (الخضراء). فرسيكان (أحمر) ترسم حليمة الجلد والنوى كانت التسمية مع هويشت (الأزرق). وأعرب عن GFP علما تحديدا في الخلايا الجلدية ولكن ليس في الخلايا الكيراتينية المحيطة بها. شريط مقياس يدل على 20 ميكرون.
Discussion
المقايسات إعادة تجديد الشعر توفير الجهاز الفريد نموذجا لفحص آلية نوفو دي الشعر تشكيل المسام. هنا، نحن تصف شعرة غرفة الفحص تعديل مفيدة لتحديد وظائف الجينات في تشكيل بصيلات الشعر. ويستند لدينا فحص على الفحص غرفة أفادت إعادة الشعر 5، 6،11، ونحن لإدخال تعديل أسلوب التعبير lentiviral لتحقيق overexpression الجينات أو ضربة قاضية إما في الجلد أو أنواع الخلايا البشرة. مقايسة التي قمنا بها توفر البديل السريع لتوليد الأنسجة محددة خروج المغلوب الوراثية. هذا الاختبار يسمح لنا لعرض وظيفة الجين في تشكيل بصيلات الشعر في اقل من ثلاثة أسابيع من إصابة الخلايا الأولية مع الفيروسة البطيئة لمجموعة الكسب غير المشروع. ويمكن تمديد مقايسة لدينا لمعالجة التفاعلات الجينية باستخدام مزيج shRNA / تسليم [كدنا] من الفيروسة البطيئة إلى نوع خلية واحدة 12، وكذلك يسمح فحص الإشارات بين الخلايا الجلدية الطباع والبشرةوفاق.
هو الانسب لدينا فحص للكشف عن الشعر القوي مكسب أو الخسارة من وظيفة الظواهر في تجديد بصيلات الشعر، بينما عيوب خفية يصعب مراقبة. لقد أثبتنا بنجاح الجلدي وظيفة جين معين من الجينات القليلة باستخدام مقايسة لدينا تجديد الشعر 1،12. أثبتنا يعتمد على علامة GFP شارك في ناقلات الفيروسة البطيئة أعرب عن التعبير عن shRNA 10، معربا عن أن shRNA الخلايا الجلدية المانحة استمرت في الطعوم الشعر مجدد. كانت GFP إيجابية الخلايا الموجودة في الجلد حليمة (DP) من بصيلات الشعر مجدد (الشكل 3). تألفت الخلايا DP المحتمل لمستويات مختلفة من الجينات ضربة قاضية كما أعرب الخلايا مستويات مختلفة من GFP، وبالتالي بصيلات الشعر المرصودة النمط الظاهري كان مجموعة من ناقص المفعول الوراثية إلى قيمة خالية.
واحد لتحسين هذا الاختبار هو إنشاء مجموعة سريعة وفعالة للخلايا shRNA عالية معربا عن قبل graftinز مثل استخدام FACS GFP لتنقية قوية، معربا عن الخلايا. والبديل هو استبدال خلايا متحولة أو خروج المغلوب الشرطي في هذا الاختبار 9. من ناحية أخرى، وهو نظام يمكن ان يحفظ الثقافة DP ظيفة الخلية مفيد جدا لفقدان الفاعلية تدريجيا DP بمجرد passaged الخلايا الأولية الجلدية. نظم الاستزراع المحتملة تشمل استخدام المواد الحيوية المستمدة من مكانة مصطنعة أو الثقافات تجميع 2،7،8،13. وسوف يكون آخر لتوليد تحسين موثوق تجميد الخلايا البشرة طريقة بمعدل خلية الانتعاش عالية حيث سيؤدي ذلك إلى تقليل استخدام المجموعة الثانية من الجراء الماوس (الخطوة 7) لتوليد الخلايا الكيراتينية جديدة في الجلد خاصة خسارة أو مكسب من بين- وظيفة الدراسات.
هذا الاختبار الشعر الشعر الكثافة غرفة تنتج المسام ونوعية مماثلة لجلد الفأر العادي، على الرغم من نمو الشعر هو أقل قليلا متزامنة والتوجه جريب أكثر عشوائية. امب عدد قليل من القيود من الشعر الفحص الجيني التجديده شرط كمية كبيرة من الفيروسة البطيئة وأرقام الخلية، وأنه هو العمل المكثف جدا من حيث الأساليب الجراحية مقارنة مع أشكال أخرى من إعادة فحوصات الشعر مثل التصحيح والمقايسات رفرف 3،4،14. ومع ذلك، فإن نوعية بصيلات الشعر والجدول الزمني للكشف عن نمو الشعر متفوقة على غيرها من المقايسات 4. لدينا تجديد الشعر استهدفت فحص يوفر رفيق سريعة ومريحة لنماذج الوراثية الموجودة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA 1F32CA14208701 (SXA) ومنح المعاهد الوطنية للصحة وAR052785 AR046786 (AEO وW. MW-).
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comments |
| PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
| AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
| AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | |
| Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
| Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
| Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
| Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
| 70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
| 15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
| 23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
| Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
| Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
| Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
| Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
| Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
| Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
| Materials | |||
|
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Collagenase solution 0.25% (w/v) Collagenase, Type 1 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin 2.5 μg/ml Fungizone 50 μg/ml Gentamycin Polybrene solution HBSS |
References
- Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling. Dev Cell. 19, 270-283 (2010).
- Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).
- Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).
- Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution. Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).
- Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice. J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
- Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction. Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).
- Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev. 22, 543-557 (2008).
- Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).
- Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).
- Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).
- Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration. Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).
- Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells. J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).
Tags
Genetic AnalysisEpithelial-mesenchymal SignalingHair RegenerationHair Follicle MorphogenesisOrgan DevelopmentLentivirusOverexpressionShRNA-mediated KnockdownGain-of-function AnalysisLoss-of-function AnalysisPrimary Mouse KeratinocytesDermal CellsDermal Papilla CellsHair FolliclesNude MiceGenetic Models
Cite This Article
Woo, W., Atwood, S. X., Zhen, H. H., Oro, A. E. Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration. J. Vis. Exp. (72), e4344, doi:10.3791/4344 (2013).