ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

1. הכן 0-2 ימי עכברים ילודים ישנים לנתיחת עור להרדים גורי עכבר באמצעות 2 קאמריים CO לפחות 20 דקות. השאר גורים על קרח עד שעה עד לנתיחה. עכברי P0-P2 מומלצים מאוד כפי שהוכנו מתאי עכברים מבוגרים להיות נמוכים מוליד כי תוצאות השתלת תשואות נמוכות יותר. הכן צלחת אחת של אתנול 70% (לצעד 1.3) ושלוש מנות של תמיסת שטיפה (לשלב 3) כאשר מוכן לבצע נתיחת עור. הפשר פתרון Dispase ולהשאיר אותה ב 4 ° C. צוואר רחם נקוע גורים לאחר חשיפת יתר 2 CO כדי להבטיח המתת חסד. הנח גורים מורדמים בצלחת תרבות על קרח והעברה למכסת מנוע זרימת סטרילי. שטוף את הגורים על ידי טבילה קצרה באתנול 70% ומקום על צלחת תרבות סטרילי. 2. לנתח עור של עכבר לחתוך כל איבר וזנב בבסיס של פלג הגוף עליון עם מספריים סטריליים. לתפוס את הגוף בחוזקה בין זוג המ"קמלקחי rved ועושה חתך לאורך העור הגבה מראש אל זנב באמצעות אזמל מבלי לחדור fascia הבסיסי. מקלף בזהירות את העור מקו האמצע של העכבר. לתפוס את העכבר נחשף בחוזקה בצד הארוך של המלקחיים המעוגלים ולהכניס עוד זוג מלקחיים מעוקלים מתחת לעור בקצה האחורי של העכבר ומשוך בעדינות עור מעל ירכיים כלפי מחצית הגחון של העכבר. הזהירות לקלף עור לחלוטין את העכבר בתנועה חלקה אחת ולהשליך את הפגר. 3. לשטוף את העור ודגירה עם פתרון Dispase הנח את העור במנה הראשונה של פתרון לשטוף עם הדרמיס בצד. מורח את העור ולהתסיס עם מלקחיים. להשאיר את העור במנה הראשונה של פתרון לשטוף תוך ביתור העור הבא. לאחר שהניח את העור הגזור הבא במנה הראשונה של פתרון לשטוף, להעביר את העור לפני המנה השנייה של פתרון לשטוף. שמור עורות בדואר פתרון לשטוף 2 עד שכל העורות נאספים. להעביר את כל העורות לשטיפה הסופית, להתסיס בקצרה. הוסף Dispase קר כקרח מ"ל 10 למנת תרבות סטרילי 10 סנטימטרים. העברת עור לפתרון Dispase ומשטח את עור הדרמיס בצד. לצוף עור ל8-16 שעות ב 4 ° C (אופציה חלופית: 1 שעה על 37 מעלות צלזיוס). 4. דרמיס ואפידרמיס הנפרד העברת עור לצלחת סטרילית תרבות חדשה ומשטח את עור הדרמיס בצד. זהירות החזק את הדרמיס מפינה אחת עם אזמל. לתפוס את האפידרמיס עם מלקחיים ולאט לאט מתקלף מהדרמיס. אפידרמיס צריך לקלף כמקשה אחת. האפידרמיס יהיה לבן ודק והדרמיס צריך להיות חום, עבה יותר, ודביק. הפרד את שתי רקמות לתוך מנות התרבות סטריליים נפרדות. כדי להפוך את שתל מציאה / ביטוי יתר עור ספציפי גן, לקחת הדרמיס ובשר טחון לחתיכות קטנות מאוד עם לאאזמלי וו. השלך האפידרמיס. ביום של זיהום (שלב 7), לנתח את סדרה נוספת של עורות עכבר כדי להכין את תאים טריים, שלא טופלו אפידרמיס לשלב עם תאי עור lentiviral-נגועים. כדי להפוך את שתל מציאה / ביטוי יתר אפידרמיס ספציפית גן, פורס כל אחת לאפידרמיס 6-8 חתיכות קטנות יותר. השלך הדרמיס. ביום של זיהום (שלב 7), לנתח את סדרה נוספת של עורות עכבר כדי להכין את תאי עור שלא טופלו טריים, לשלב עם תאי אפידרמיס lentiviral-נגועים. 5. לנתק את תאים ראשוניים עכבר (Dermal mDCs) מרקמות טחונות לנתק mDCs ידי דוגר חתיכות עור עם פתרון collagenase טרי על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. השתמש 10 מ"ל של פתרון collagenase לעכבר גור. בעדינות מערבב הדרמיס תמיסה המכיל כל 10 דקות. בדקו את מידת הניתוק תחת מיקרוסקופ; השעית התא מתעכלת צריכה להיות בעיקר תאים בודדים. הפתרון צריך לשנות מברור מעורפלת כמותאי עור הם ניתקו מהדרמיס. הוסף FBS לפתרון collagenase מכיל הדרמיס לנפח סופי של 10% להפחתת הפעילות של collagenase. להעביר את השעית התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש מ"ל 50 להסיר גושים גדולים לא מעוכלים ושלמים זקיקים. הוסף 10 מ"ל של DMEM/10% FBS ל30 מ"ל של הזרימה דרך לדלל collagenase נוסף. צינורות המכילים צנטריפוגות הדרמיס מתעכל ב30 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות נוספות כדי להסיר זקיקים שלמים. בזהירות להעביר את supernatant לצינור מ"ל חדש 50. תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב 200 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות. Resuspend תאים עם DMEM/10% FBS (1 מ"ל לכל גור) וספירת תאים. תאי צלחת עם C-100 תקשורת Amniomax לזיהום (שלב 7), או לשלב עם KC lentivirus הנגוע להשתלה (שלב 9). תשואה אופיינית היא 20 x 10 6 תאים לכל גור. 6. לנתק keratinocyte הראשיs (KC) מרקמות טחונות לנתק KC ידי דוגר חתיכות אפידרמיס עם 0.05% מופשרים טרי טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השתמש 7 מ"ל של טריפסין-EDTA לעכבר גור. עדינות פתרון מערבולת המכיל אפידרמיס כל 5 דקות. הוסף נפח שווה של פתרון לנטרול האפידרמיס מכיל טריפסין-EDTA לצמצם את הפעילות של טריפסין. תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב 200 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות. רקמות מעוכלות נותרות צריכות לצוף למעלה. זהירות לשפוך את רוב supernatant עם רקמות מעוכלות. הסרת supernatant נותר עם פיפטה 10 מ"ל ללא תא גלולה מטרידה. Resuspend תא גלול עם PBS. במקרה KCs אינו pelleted לחלוטין, יוצק את רוב supernatant וחזור צנטריפוגה עד שרוב התאים נמצאים pelleted. מסנן השעית תא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש להסרת רקמה או גושים שנותר. תאי גלולה ידי צנטריפוגהב 200 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות. תאי resuspend ב-CNT-07 תקשורת או PBS (מ"ל 1 לכל גור) ותאים לספור. השתמש CNT-07 לתאי ציפוי לזיהום (שלב 7), השתמש PBS לשלב עם mDCs lentivirus הנגוע להשתלה (שלב 9). תשואה אופיינית היא 03-10 אוקטובר 6 תאי x ללבונה. 7. להדביק תאים ראשוניים עם lentivirus המכיל shRNA או cDNA ביום של זיהום לנתח קבוצה נוספת של עורות עכבר כדי להכין KCs טרי, שלא טופל ראשוני או mDCs לשלב עם תאים נגועים בנגיף ביום של השתלה (שלב 9). לmDCs, צלחת 4 X 10 6 mDCs לצלחת 10-סנטימטר עם תקשורת AmnioMAX-C100 ולדגור על 37 ° C + CO 2 5% לזיהום למחרת ב 50% צפיפות תאים. צלחות בדרך כלל 3-4 של mDCs משמשות ליצירת שתל אחד, וכן סך של 10-12 צלחות נדרשים כדי ליצור שלושה שתלים בניסוי אחד. לחלופין, בואו mDCs לצרף ולהתפשט fאו מינימום של 2 שעות ב 37 ° C + CO 5% 2 ולבצע זיהום באותו היום של ציפוי תא. mDCs תהיה מורפולוגיה פיברובלסטים-אוהב. לKC, צלחת 12 x 10 6 KC לצלחת 10-סנטימטר עם-07-CNT תקשורת ולדגור על 37 ° C + CO 2 5% לזיהום למחרת. לחלופין, בואו KC לצרף והתפשט למינימום של 2 שעות ב 37 ° C + CO 5% 2 ולבצע זיהום באותו היום. צלחות בדרך כלל 3-4 של KC משמשות ליצירת שתל אחד. סכום כולל של 10-12 צלחות נדרשים כדי ליצור שלושה שתלים לניסוי אחד. KCs תהיה מורפולוגיה מרוצפת אבן. Preincubate תאים לדקות 5-10 עם מיקרוגרם 8 / פתרון Polybrene מ"ל ב 37 ° C + 5% CO 2. בורסת מדיה ולהוסיף lentivirus + 8 מיקרוגרם / מיליליטר פתרון Polybrene. כייל lentiviral ישתנה בהתאם לשימוש, ולבנות צריך להיקבע לפני הזיהום. צנטריפוגה הצלחות ב 200 XG בצנטריפוגה שולחן, לשעת 1 ב 32 °, C כדי להדביק תאים עם lentivirus. הסר את המדיה lentivirus המכיל ולהוסיף תקשורת טריה. לKC, לשטוף תאים פעם עם PBS לפני הוספת גב תקשורת טריה. תאים נגועים בדרך כלל לשחזר את הלילה על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2. לחלופין, לאפשר לפחות שעות של התאוששות ב 37 ° C + 5% CO 2 לפני trypsinizing התאים להשתלה. המשך לתרבות בחלק קטן מתאים נגועים לבדיקת יעילות זיהום כמתואר בסעיף תוצאות הנציג. 8. הכן את התאים נגועים להשתלה מבודד mDCs העיקרי טרי או KCs מעור באמצעות צעדים 4-6. תאי resuspend בקרח הקר PBS סטרילית. ספירת תאים. לשתל מציאה / ביטוי יתר עור ספציפי גן, לנתק mDCs הנגוע מצלחות באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 8. לשתל מציאה / ביטוי יתר אפידרמיס ספציפית גן, לנתק KC הנגוע מצלחות USIng 0.125% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לנטרל את פעילות טריפסין באמצעות DMEM + 10% FBS (mDCs) או פתרון נטרול (KC). להעביר את תאי trypsinized לצינור מ"ל 50. תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב 200 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות. תאי resuspend בקרח הקר PBS סטרילית. ספירת תאים. שלב את התאים הנגועים בנגיף עם סוג התא טרי ללא טיפול המקביל. לשתל אחד, לשלב 7-10 x 10 6 mDCs עם 07-10 אוקטובר 6 KCs x בקרח הקר PBS סטרילי וגלולת תרחיף התאים בצנטריפוגה שולחן ב 4 ° C. תאי resuspend ב -100 μl קרח הקר PBS סטרילי 50. שמור על תאים על קרח עד תאים נו / נו עכברים מוכנים. 9. צור מיטת פצע ולשכת תקן על גב של נו / נו מאוס יום לפני ההשתלה, לעקר כלים כירורגיים בתאי סיליקון חיטוי ועקרים על ידי שרייה באתנול 70%. החלף etha 70%נול עם PBS סטרילי לפני השימוש בתאים. הרדם נו / נו עכבר (7-12 נקבות בשבוע ישנות) באמצעות קטמין (8 מ"ג / מ"ל) / xylazine (1.6 מ"ג / מ"ל) באמצעות הזרקת intraperitoneal (100 μl/10 משקל הגוף ז) או שיטה מועדפת אחרת. החל סיכת עין. כרית חימום מקום תחת עכבר. לחטא את העור בחזרה עכבר עירום עם יוד ולנקות עם מטליות אלכוהול. הוסף 1-3 טיפי Bupivicaine 0.25% לאתר החתך topically. צבוט את עור עכבר העירום בבסיס הצוואר עם מלקחיים. חתוך חור עגול קטן (~ 1 סנטימטר קוטר) בעור צבט במספריים סטריליות. הנח חדר הסטרילי על מיטת פצע ולכסות קצוות קאמריים עם עור מסביב. תא מאובטח למקום עם תפרים לאורך קצוות קאמריים (6 תפרים בחדר) כפי שמוצג באיור 2 א. כאשר תאים מוכנים, עדינות slurry מערבולת התא, וירשמו למחט 23 מד מצורפת מזרק 1 מ"ל. אם תרחיף תא מרוכז בחלק התחתון, בעדינותresuspend עם קצה פיפטה 1 מ"ל לפני הציור למחט. קאמרי לנקב עם מחט ולטפטף באיטיות על גבי תאי פצע. עכברי מקום לכלובים נקיים, autoclaved. בית 2 עכברים לכלוב ולהוסיף אנטיביוטיקה וטיילנול (3 מ"ג / מ"ל) למי שתייה. מניסיוננו, שני נקבות עכברים לכלוב לא הביאו לטראומה שלילית לקאמריים, שתל, או בעלי חיים. הנח כרית מתחת להתחממות מחצית הכלוב ולהתבונן בעכברים עד ההרדמה פגה. 10. הסר קאמרי לאחר 7-9 ימים הרדם נאוטילוס נו / נו עכבר כמו בשלב 9.1. החל סיכת עין. לחטא את העור סביב קאמרי עם יוד ולנקות עם מטליות אלכוהול. חתכתי את התפרים ולהוציא מתא. בעדינות להסיר קאמרי מעכבר. אם מקלות השתלת עור חדשים לקאמריים, להרים חלק מקאמרי ושתל עדינות נפרד מחדר באמצעות מלקחיים. החזק את השתל במהלך ההסרה של החדר. שתל צריך שירותיםk עמום ומעורפל כמו באיור 2B. החל משטח שאינו חסיד עם סרט דק של אנטיביוטיקה על הפצע הפתוח ותפר למקומו (2 תפרים). לעטוף תחבושת סביב עכבר כדי לאבטח את הכרית ולהגן על הפצע. לתפור תחבושת למקומה. תאי סיליקון מנוקים ע"י שפשוף עם סבון עדין ולשטוף ביסודיות עם מי deionized. משרה את התאים באתנול 70% בין הלילה, אוויר יבש, וחנות. 11. בחן את העכבר לצמיחת שיער הסרת תחבושות ומשטח לאחר 3 ימים של הסרה קאמרית. שתל צריך להיות יבש ואטום לצבע חום. בדקו עכברים מעת לעת לצמיחת שיער. שיער צריך להתחיל להראות ב16 ימים לאחר השתלה. הליך מדורג יום 1 (2-3 שעות): הקרב את גורים שזה עתה נולדו, להסיר את העור, ולהשאיר על dispase ב 4 ° C למשך הלילה. יום 2 (2-3 שעות): מבודד את התאים ראשוניים מעור וצלחת בצפיפות תאים מומלצות. יום 3 (שעות 3-4): להדביק תאים עם lentivirus. הסרת עור מסדרה נוספת של גורים שזה עתה נולדו ותעזוב בdispase ב 4 ° C למשך הלילה. יום 4 (6-8 שעות): מבודד את התאים ראשוניים מעור, לספור, ומשאיר על קרח. שחזור תאי lentivirus נגועים על ידי trypsinization וצנטריפוגה, לספור ולשלב 7-10 x 10 6 תאי הקרטינוציטים ועור ל50-100 μl של PBS לשתל. צור מיטת פצע בעכבר, לצרף קאמרי, ולהחיל תערובת תא לפצוע את המיטה. נוהל מתווה אלטרנטיבי קווי מתאר הליך חלופיים יהיו לקצר את ההליך מארבעה ימים לשלושה. שלב את יום 1 ויום 2 על ידי טיפול בעור העכבר dispase על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת (שעת 5-7 זמן משוער). שלב יום 2 ויום 3 על ידי הדבקה של תאים עם lentivirus לאחר תאי ציפוי לשעות (שעה מוערכת זמן 5-7).