איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי
Summary
שיטה של התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.
Abstract
שיטות קלסיות לחקר מעגלים עצביים הן תפוקה נמוכה למדי. וירוסי Transsynaptic, במיוחד pseudorabies (PRV) ונגיף כלבת (RABV), ולאחרונה שלפוחי וירוס stomatitis (VSV), ללימוד מעגלים, יותר ויותר פופולריים. שיטות תפוקה גבוהות אלה להשתמש וירוסים שמשדרים בין הנוירונים בשני כיווני אנטרוגרדית או מדרדר.
לאחרונה, RABV שונה לאיתור מדרדר monosynaptic פותח. (איור 1 א). בשיטה זו, גליקופרוטאין הגן (G) נמחק מהגנום הנגיפי, והצטייד במצרכים רק בנוירונים ממוקדים. הספציפיות זיהום מושגת על ידי החלפת G chimeric, מורכב מהתחום התאי של ASLV-גליקופרוטאין ותחום cytoplasmic של RABV-G (/ RG), לנורמלי 1 RABV-G. G chimeric זה במיוחד מדביק תאים המבטאים את הקולטן TVA 1. גן קידוד TVA יכול היה דelivered על ידי שיטות שונות 2-8. בעקבות זיהום RABV-G של נוירון TVA מבטא, RABV יכול לשדר לנוירונים אחרים, הקשורות בsynaptically כיוון מדרדר ידי הטבע של G שלו אשר היה השותף נמסר-עם קולט TVA. טכניקה זו מתייגת מספר רב יחסי של תשומות (5-10%) 2 על סוג תא מוגדר, מתן דגימה של כל תשומות על סוג תא תנע מוגדר.
אנחנו שונים לאחרונה בטכניקה זו כדי להשתמש VSV כ9 נותב transsynaptic. VSV יש מספר יתרונות, כולל המהירות של ביטוי גנים. כאן אנחנו פירוט מערכת איתור נגיפית חדשה באמצעות VSV השימושי לחקור microcircuitry עם רזולוציה מוגברת. בעוד אסטרטגיות המקוריות שפורסמו על ידי Wickersham et al. 4 ו אייר et al. תיוג 9 היתר של כל הנוירונים שמשליכים על נגוע, תחילה TVA-להביע תאים, כאן VSV תוכנן לשידור רק לטלביזיהתאים המבטאים-(האיור 1B). וירוס pseudotyped הראשון עם RABV-G להתיר זיהום של מורד הנוירונים של נוירונים המבטאים TVA-. לאחר הדבקת האוכלוסייה ראשונה זה של תאים, הווירוס יכול להדביק תאים שוחרר TVA מבטא בלבד. בגלל ההתפשטות הנגיפית transsynaptic מוגבלת לתאים המבטאים TVA-, נוכחות של העדר קישוריות מסוגי תאים מוגדרים ניתן לחקור ברזולוציה גבוהה. תרשים זרימה ניסיונית של ניסויים אלה מוצג באיור 2. כאן אנו מציגים מודל מעגל, שכיוון של-הסלקטיביות ברשתית העכבר. אנו בודקים את הקישוריות של תאי התפרצות כוכבי amacrine (צקים) לתאי הגנגליון ברשתית (RGCs).
Protocol
Discussion
שימוש בוירוסים כדי ללמוד מעגלים עצביים הוא שיטת תפוקה גבוהה יחסית של ניתוח נוירונים מקושרים. עם זאת, שהניב גם virions RABV VSV ואינו טריוויאלי. למרות שהפרוטוקול מפורט לעיל להצלת וירוס מcDNA מסופק, זה עדיין אירוע הסתברות נמוכה. הרמות של כל אחד מN, P, ופלסמידים L צריכות להיות מותאמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות שון וילן לסיוע בהצלת ריאנטים VSV רקומביננטי, וDidem גוז וריאן Chrenek לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי HHMI (CLC), ו# NS068012-01 (KTB).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
