Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry
Summary
Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.
Abstract
Klassische Methoden zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise sind ziemlich geringen Durchsatz. Transsynaptische Viren, insbesondere das Pseudorabiesvirus (PRV) und Tollwutvirus (RABV) und neuerdings vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV), eine Schaltung zur Untersuchung, wird immer beliebter. Diese höheren Durchsatz Methoden verwenden Viren, die zwischen den Neuronen entweder in der anterograde oder retrograde Richtung übertragen.
Kürzlich wurde eine modifizierte RABV für monosynaptischen retrograden Tracing entwickelt. (Abbildung 1A). Bei diesem Verfahren wird das Glycoprotein (G)-Gen aus dem viralen Genom gelöscht und wieder zugeführt nur in gezielter Neuronen. Infektion Spezifität wird durch Substituieren eines chimären G, der extrazellulären Domäne des ASLV-A Glykoprotein und die zytoplasmatische Domäne des RABV-G (A / RG) zusammengesetzt ist, für die normale RABV-G 1 gelöst. Dieses chimäre G gezielt infiziert Zellen, die den TVA-Rezeptor-1. Das Gen kodiert TVA kann schon delivered durch verschiedene Verfahren 2-8. Nach RABV-G Infektion einer TVA-exprimierenden Neuronen, kann die RABV zu anderen, synaptisch verbundenen Neuronen in retrograder Richtung von der Natur des eigenen G, die mit dem Rezeptor TVA zusammen geliefert war zu übertragen. Diese Technik kennzeichnet eine relativ große Anzahl von Eingängen (5-10%) 2 auf einem definierten Zelltyp, Bereitstellen eines Probenahme von allen Eingängen auf einen definierten Starter Zelltyp.
Wir haben vor kurzem diese Technik, um VSV als transsynaptische Tracer 9 verwenden modifiziert. VSV hat mehrere Vorteile, einschließlich der Schnelligkeit der Genexpression. Hier haben wir ausführlich eine neue virale Tracing-System mit VSV nützlich für das Sondieren Mikrotechnik mit erhöhter Auflösung. Während die ursprünglich veröffentlichten Strategien Wickersham et al. 4 und Beier et al. 9 Erlaubnis Beschriftung bei allen Neuronen, projizieren eingangs infiziert TVA-exprimierenden-Zellen, hier VSV dazu entworfen wurde, um nur zu übertragen, um TVA-exprimierenden Zellen (Abb. 1B). Das Virus wird zuerst mit RABV-G pseudotypisiert zur Infektion von Neuronen hinter TVA-exprimierenden Neuronen ermöglichen. Nach der Infektion dieses ersten Population von Zellen, das Virus freigesetzt nur infizieren TVA-exprimierenden Zellen. Weil die transsynaptische viralen Ausbreitung auf TVA-exprimierenden Zellen, die Anwesenheit von Abwesenheit von Konnektivität von definierten Zelltypen beschränkt wird dann mit hoher Auflösung untersucht werden. Eine experimentelle Flußdiagramm dieser Versuche ist in Abbildung 2 gezeigt. Hier zeigen wir, ein Modell-Schaltung, dass der Richtungswechsel-Selektivität bei der Maus Netzhaut. Wir untersuchen die Konnektivität starburst Amakrinzellen (SAC) an retinalen Ganglienzellen (RGZ).
Protocol
Discussion
Verwendung von Viren zu studieren neuronalen Schaltkreise ist eine relativ hohe Durchsatzleistung Verfahren zum Analysieren angeschlossenen Neuronen. Allerdings Erzeugung sowohl VSV und RABV Virionen ist nicht trivial. Obwohl die obige Protokoll zur Rettung Virus aus cDNA aufgeführten vorgesehen ist, ist es immer noch ein geringer Wahrscheinlichkeit Ereignis. Die Niveaus von jedem der N, P, und L Plasmide müssen fein eingestellt werden, und viele Studien und repliziert müssen getan, um virale Rettungs gewährleisten….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Sean Whelan zur Unterstützung bestätigen Sie mit Rettung rekombinanten VSV Varianten und Didem Goz und Ryan Chrenek für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von HHMI (CLC) unterstützt, und # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
