Быстрое выделение жизнеспособного циркулирующих опухолевых клеток из образцов крови пациентов

Следующий протокол для производства одного устройства микропробирок. 1. Подготовка галлуазит Решение нанотрубок Разрушать ультразвуком (10-13 Вт (RMS)) 250 мкл раствора нанотрубок галлуазит (6,6% вес в воде), 30 сек. Холодный раствор холодной водой и повторите обработку ультразвуком раз. Охладить снова. Нарисуйте ультразвуком раствор в шприц, приложите 0,45 мкм шприц фильтр и фильтр раствор в чистую пробирку и отцентрифугировать. Vortex решения иногда для поддержания однородности. 2. Покрытие микропробирку внутренней поверхности нанотрубки с галлуазит Получить длиной 50 см раздел Micro-Renathane microtubing (300 мкм, внутренним диаметром 35,3 мкл внутреннего объема). Отрежьте один конец микропробирки по диагонали и вставить небольшой кусочек адаптер IDEX. Вставьте иглу 3/10 см 29G шприца в другой конец микропробирок. Для очистки микропробирок, поместить в открытый конец микропробирок (конецс адаптером) в 70% этанола и ничья ~ 50 мкл этанола в шприц для заполнения микропробирок. Промойте этанола из микропробирок, опираясь щедрый объем дистиллированной воды в шприц. Отсоедините шприц от микропробирок, очистить шприц, а затем присоединить к микропробирок. Приготовьте раствор 0,02% в / о поли-L лизина в воде. Рисуем 50 мкл в микропробирок и позволяет сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Нарисуйте 100 мкл фильтруется нанотрубок решение в микропробирок и позволяет инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре. Нарисуйте 100 мкл воды через микропробирок для полоскания из нанотрубок решение. Позвольте покрытием микропробирку сидеть, наполненный водой, на ночь при комнатной температуре. 3. Подготовка пробирок для сотового изоляция Приготовьте раствор 10 мкг / мл белка G в фосфатных 1X Дульбеко буферным раствором (PBS, рН 7.0 – 7.2). Рисуем 50 мкл PBS через микропробирок, а затем сделать 50 мклбелок-G решение и позволяет инкубировать в течение 1,5 часа при комнатной температуре. Приготовьте раствор, содержащий 5 мкг / мл E-селектина-IgG и 50 мкг / мл антитела (анти-EpCam для большинства образцов рака, борьбы с ПСМА простаты образцов рака) в PBS. Рисуем 50 мкл E-селектина и раствор антител в микропробирок и позволяет инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре. Неспецифические клеточной адгезии блокируется с 5% молочного белка. Приготовьте раствор 5% (вес / объем) молочного белка в PBS. Рисуем 50 мкл раствора белка молока в микропробирок и позволяет инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Рисуем 50 мкл PBS в трубку и оставить при комнатной температуре до образцов крови или лейкомассы готовы к обработке. 10 минут перед использованием микропробирок для изоляции, привлечь 50 мкл PBS, который был насыщенным Ca 2 + ("PBS +"), чтобы активировать селектина молекул. 4. Подготовка проб для изолятор Нарисуйте или получить 10 мл крови пациента в гепаринизированнойтрубы. Место 10 мл Ficoll-лимфоцитов Paque решение изоляции в 50 мл трубы центрифуги. Осторожно слой 10 мл цельной крови на вершине Ficoll, чтобы не смешивать кровь и Ficoll. Центрифуга в 2000x г в течение 15 мин при 4 ° С с минимальным замедлением. Удалите слой лейкомассы и место в новой трубки. Wash лейкомассы с PBS (центрифуги в 230x г в течение 10 минут, удалите супернатант). Осторожно ресуспендирования клеток с 1 мл буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре для лизиса эритроцитов. Добавить 10 мл PBS, аккуратно перемешать, а центрифуги в 230x г в течение 10 мин. Удалите супернатант и осторожно ресуспендируют осадок от 3 до 4 мл PBS +. 5. Сотовые изоляции Подключите один конец функциональными микропробирок в 5 мл шприц использованием IDEX адаптеров. Вставьте шприц на шприцевой насос. Погрузитесь в открытый конец функциональными микропробирок в клетку Suspensioл. Процесс клеточной суспензии через микропробирки от 1 до 4 мл / час. Передача открытого конца микропробирки в пробирку, содержащую PBS + и привлечь 300 мкл PBS + в шприц на 0,016 мл / мин для удаления несвязанных и слабо связаны с клетками микропробирок. Поместите открытый конец микропробирок в чистую пробирку. Отсоедините шприц от микропробирок и присоединить шприц заполнено с Accutase. Осторожно заливать достаточно Accutase в микропробирки для заполнения (~ 50 мкл) и позволяет инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Присоединить шприц заполнено с 1 мл питательной среды (79% RPMI, 20% FBS, 1% пенициллина стрептомицин) и заливать в микропробирки, сбор сточных вод в культуре ткани хорошо относились пластины. Культуры клеток при 37 ° С и 5% CO 2 при увлажненных условиях. 6. Представитель Результаты Цель этого метода заключается в изоляции жизнеспособные раковые клетки из крови больных раком. Существует несколько методов для выявления раковых клеток в культуре, необходимые проверки устройств успеха. Мы выбрали для окрашивания клеток в культуре с антителами против эпителиальных остатков, таких как EpCam (эпителиальные сотовой молекулы адгезии) или ПСМА (простат специфический антиген мембраны), в дополнение к DAPI определить нетронутыми ядрах клеток (рис. 2 и 3). Число раковых клеток получены с помощью этой техники обязательно функцией количества ЦОК в стартовом образца, а пациент изменчивость может быть высокой. При обработке образцов, взятых у пациентов с диагнозом рак IV стадии, мы обычно захвата от 100 до 500 раковых клеток в трубке кровь, на чистоты> 50%. Сразу же после изоляции, большее количество загрязняющих лейкоцитов может присутствовать. Однако эти цифры будут исчерпаны после инкубации в питательной среде в течение 5 дней. <stРонг> Рисунок 1. Схема функциональными микропробирок для ТХМ в изоляции, показывая селектин-опосредованной прокатки следует антитело-опосредованной статического сцепления. Рисунок 2. Представителю данные изоляции CTC из образцов крови взяты из пациентов рака молочной железы и рака легких пациента. Количество жизнеспособных клеток идентифицированы как СТС на основе окрашивания EpCam представлен твердой баров и относятся к левой оси ординат, а процент клеток, которые были определены как СТС по сравнению с общим числом захваченных клеток представлены открытые бары и измеренная на правом ординат. Результаты следующие пять дней в культуре. Рисунок 3. Представитель микрофотографии от отдельных доноров (А и Б) ТХМ в культуре 5 дней после isolatiна из крови больного раком. Клетки окрашивали флуоресцентно для EpCam с AlexaFluor 488 (зеленый) и 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для визуализации ядра (синий).