Isolement rapide des cellules tumorales circulantes viables partir d'échantillons sanguins des patients

Le protocole suivant est pour la production d'un dispositif unique microtube. 1. Préparation de la solution de nanotubes halloysite Soniquer (10-13 W (RMS)) 250 uL solution de nanotubes halloysite (6,6% en poids dans l'eau) 30 sec. Solution refroidir à l'eau froide et sonication répéter une fois. Refroidissez à nouveau. Dessiner solution soniqué dans une seringue, fixer un filtre de 0,45 um seringue, et la solution du filtre dans microtube propre. Vortex la solution de temps en temps pour maintenir l'homogénéité. 2. Revêtement de surface microtube intérieur avec des nanotubes de halloysite Obtenir 50 cm longue section de Micro-Renathane microtubing (300 um de diamètre intérieur, 35,3 ul de volume interne). Couper une extrémité du microtube en diagonale et l'insérer dans une pièce IDEX petit adaptateur. Insérez l'aiguille d'une seringue 3/10 cc 29G dans l'autre extrémité du microtube. Pour nettoyer le microtube, placez l'extrémité ouverte du microtube (la finavec l'adaptateur) dans l'éthanol à 70% du tirage de l'éthanol à 50 ~ ul dans la seringue pour remplir microtube. Rincer l'éthanol sur le microtube en attirant un volume généreux de l'eau distillée dans la seringue. Détacher la seringue du microtube, vider la seringue, puis la rattacher à la microtube. Préparer une solution de 0,02% p / v de poly-L lysine dans l'eau. Dessiner 50 uL dans le microtube et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante (RT). Dessiner une solution de 100 ul de nanotubes et filtré dans le microtube et laisser incuber pendant 3 min à température ambiante. Dessinez 100 pi d'eau à travers le microtube pour rincer la solution de nanotubes. Laisser microtube revêtu de s'asseoir, rempli d'eau, une nuit à TA. 3. Préparation de microtubes pour l'isolement cellulaire Préparer une solution de 10 ug / ml à la protéine G dans le phosphate de Dulbecco 1X une solution saline tamponnée (PBS, pH 7,0 – 7,2). Dessiner 50 ul de PBS par microtube puis dessinez 50 pi dela solution de protéine-G et laisser incuber pendant 1,5 heure à température ambiante. Préparer une solution contenant 5 ug / ml E-sélectine-IgG et 50 pg / ml d'anticorps (anti-EpCAM pour la plupart des échantillons de cancer, anti-PSMA pour les échantillons cancer de la prostate) dans du PBS. Dessiner 50 pi de l'E-sélectine et une solution d'anticorps dans le microtube et laisser incuber pendant 2 h à température ambiante. Non spécifique adhésion cellulaire est bloqué avec des protéines de lait de 5%. Préparer une solution de 5% (p / v) de protéine du lait dans du PBS. Dessiner une solution à 50 ul de protéines de lait dans le microtube et laisser incuber pendant 1 h à température ambiante. Dessiner 50 ul de PBS dans le tube et laisser à température ambiante avant que des échantillons de sang ou de buffy coat sont prêts pour le traitement. 10 min avant d'utiliser le microtube pour l'isolement, dessiner 50 ul de PBS qui a été saturé avec du Ca 2 + ("PBS +") pour activer les molécules de sélectine. 4. Préparation des échantillons pour l'isolement cellulaire Dessinez ou obtenir 10 mL de sang du patient dans héparinéTube. Placer 10 ml de Ficoll-Paque solution d'isolation de lymphocytes dans 50 ml tube de la centrifugeuse. Doucement couche sang 10 ml ensemble au-dessus de Ficoll manière à ne pas mélanger le sang et de Ficoll. Centrifuger à 2000x g pendant 15 min à 4 ° C avec une décélération minimale. Retirez la couche leuco-plaquettaire et le placer dans un nouveau tube. Laver avec du PBS couche leuco-plaquettaire (centrifugeuse à 230x g pendant 10 min, éliminer le surnageant). Resuspendre doucement les cellules avec 1 ml de tampon de lyse et incuber pendant 10 min à température ambiante pour lyser les érythrocytes. Ajouter 10 ml de PBS, mélanger doucement et centrifuger à 230x g pendant 10 min. Jeter le surnageant et doucement reprendre le culot dans 3 à 4 ml de PBS +. 5. Isolement cellulaire Fixez une extrémité du microtube fonctionnalisé à un seringue de 5 ml en utilisant des adaptateurs IDEX. Insérez la seringue sur une pompe à seringue. Plonger l'extrémité ouverte du microtube fonctionnalisé dans la cellule de suspension. Traiter la suspension cellulaire à travers le microtube de 1 à 4 ml / h. Transfert à l'extrémité ouverte du microtube dans un tube contenant du PBS + et d'en tirer 300 + pi de PBS dans la seringue de 0,016 ml / min pour éliminer les cellules non relié et faiblement liés du microtube. Placer l'extrémité ouverte du microtube dans un tube propre. Déconnecter la seringue du microtube et joindre une seringue pré-remplie avec Accutase. Doucement perfuser Accutase assez dans le microtube à remplir (~ 50 pi) et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min. Fixer une seringue pré-remplie avec 1 ml de milieu de croissance (79% RPMI, SVF 20%, 1% de streptomycine à la pénicilline) et perfuser en microtube, la collecte des effluents dans la culture de tissus bien traités plaque. Des cellules en culture à 37 ° C et 5% de CO 2 dans des conditions humidifiés. 6. Les résultats représentatifs Le but de cette technique consiste à isoler les cellules cancéreuses viables dans le sang de patients atteints de cancer. Plusieurs méthodes existent pour identifier les cellules cancéreuses en culture; une vérification nécessaire à la réussite appareil. Nous avons choisi pour colorer les cellules en culture avec des anticorps contre des fragments épithéliaux tels que EpCAM (molécule d'adhésion cellulaire épithéliale) ou PSMA (antigène prostatique membranaire spécifique), en plus de DAPI à identifier les noyaux des cellules intactes (Fig. 2 et 3). Le nombre de cellules cancéreuses capturé en utilisant la technique est nécessairement une fonction du nombre de CTC dans l'échantillon de départ, et à la variabilité du patient peut être élevé. Dans le traitement des échantillons prélevés sur des patients diagnostiqués avec le cancer de stade IV, nous avons l'habitude de capturer entre 100 et 500 cellules cancéreuses par tube de sang, à des puretés> 50%. Immédiatement après l'isolement, un plus grand nombre de leucocytes contaminants peuvent être présents. Toutefois, ces chiffres seront épuisées après une incubation dans un milieu de culture pour un maximum de 5 jours. <strong> Figure 1. Schéma de microtube fonctionnalisé pour l'isolement de la CCT, montrant sélectine-médiée de roulement suivie par médiée par les anticorps adhérence statique. Figure 2. Données représentatives de l'isolement de la CCT à partir d'échantillons de sang prélevés à partir d'un patient atteint de cancer du sein et un patient du cancer du poumon. Le nombre de cellules viables positive identifiés comme CCT sur la base de la coloration EpCAM est représenté par des barres solides et se rapportent à l'ordonnée de gauche et le pourcentage de cellules qui ont été identifiées comme CCT par rapport au nombre total de cellules capturées est représenté par les barres d'ouverture et de mesurée sur la droite d'ordonnée. Les résultats sont, après cinq jours de culture. Micrographies représentatives Figure 3. Des bailleurs de fonds distincts (A et B) de la CCT dans la culture 5 jours à la suite de isolatisur un échantillon de sang patients atteints du cancer. Les cellules ont été colorées pour fluorescence EpCAM avec AlexaFluor 488 (vert) et 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser le noyau (en bleu).