Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

O protocolo seguinte é para a produção de um dispositivo de microtubo único. 1. Preparação da solução de Nanotubos de haloisita Sonicado (10-13 W (rms)) 250 uL solução nanotubo haloisite (6,6% em peso em água) 30 seg. Solução legal com água fria e repita uma vez sonicação. Esfriar novamente. Desenhar solução sonicada para uma seringa, anexar um filtro de seringa de 0,45 uM, e solução de filtro para dentro do tubo de microcentrífuga limpo. Solução a vórtice ocasionalmente para manter a homogeneidade. 2. Revestimento de superfície Microtube interno com nanotubos de haloisita Obter 50 cm longa seção de Micro-Renathane microtubing (300 mM de diâmetro interior, 35,3 uL de volume interno). Corte uma extremidade do microtubo de uma diagonal e inserir um pedaço pequeno adaptador IDEX. Inserir a agulha de uma seringa 3/10 cc 29G na outra extremidade do microtubo. Para limpar o microtubo, colocar a extremidade aberta do microtubo (a extremidadecom o adaptador) em etanol 70% e draw ~ 50 uL de etanol para a seringa para encher microtubo. Lave o etanol a partir do microtubo desenhando um volume generoso de água destilada para a seringa. Retire a seringa do microtubo, esvaziar a seringa e volte para o microtubo. Prepara-se uma solução de 0,02% w / v de poli-L lisina em água. Desenhar 50 uL para o microtubo e permitir a sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Desenhar 100 uL solução nanotubo e filtrada para o microtubo e deixa-se incubar durante 3 min a RT. Desenhe 100 uL de água através do microtubo para lavar a solução de nanotubos. Permitir microtubo revestido para sentar, cheio de água, durante a noite à RT. 3. Preparação de microtubos para isolamento de células Prepara-se uma solução de 10 mg / g de proteína mL em fosfato de Dulbecco 1X salino tamponado (PBS, pH 7,0 – 7,2). Desenhe 50 uL PBS através microtubo e desenhe 50 mL dea solução de proteína G-e deixa-se incubar durante 1,5 h à RT. Prepara-se uma solução contendo 5 ug / mL E-selectina-IgG e 50 anticorpo mcg / ml (anti-EpCAM para a maioria das amostras de cancro, anti-PSMA para amostras de cancro da próstata) em PBS. Desenhar 50 uL da E-selectina e solução de anticorpo para o microtubo e deixa-se incubar durante 2 horas à RT. Adesão celular não específica é bloqueado com proteína de leite de 5%. Prepara-se uma solução de 5% (w / v) de proteína de leite em PBS. Desenhar 50 uL solução de proteína do leite no microtubo e deixa-se incubar durante 1 hora à RT. Desenhe 50 uL de PBS em tubo e deixar à temperatura ambiente até amostras de sangue ou de buffy coat está pronto para processamento. 10 min antes de utilizar o microtubo para o isolamento, desenhar 50 uL de PBS que foi saturada com Ca 2 + ("PBS +") para activar as moléculas de selectina. 4. Preparação de amostras para o isolamento de células Desenhe ou obter 10 mL de sangue de paciente em heparinizadotubo. Colocam-se 10 mL de Ficoll-Paque solução de isolamento de linfócitos em 50 mL tubo de centrífuga. Suavemente camada de sangue 10 mL todo em cima de Ficoll de modo a não misturar o sangue e Ficoll. Centrifugar a 2000x g durante 15 min a 4 ° C com desaceleração mínima. Retire a camada de revestimento buffy e coloque em novo tubo. Buffy coat lavagem com PBS (centrifugue a 230x g durante 10 min, descartar o sobrenadante). Suavemente ressuspender as células com 1 mL de tampão de lise de RBC e incubar durante 10 min a RT para lisar os eritrócitos. Adicionar 10 ml de PBS, misturar suavemente, e centrifugue a 230x g durante 10 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento suavemente em 3 a 4 ml de PBS +. 5. Isolamento das células Anexar uma extremidade do microtubo funcionalizado a uma seringa de 5 ml usando adaptadores IDEX. Inserir a seringa para uma bomba de seringa. Submergir a extremidade aberta do microtubo funcionalizado para dentro da célula suspension. Processar a suspensão de células através do microtubo de 1 a 4 mL / h. Transferir a extremidade aberta do microtubo a um tubo contendo PBS + e desenhar 300 + PBS uL em seringa a 0,016 ml / min para remover as células não ligado e fracamente ligados do microtubo. Coloque a extremidade aberta do microtubo para um tubo limpo. Desconecte a seringa do microtubo e anexar uma seringa pré-cheia com Accutase. Suavemente perfundir Accutase suficiente para o microtubo para preencher (~ uL 50) e permitir que a incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Anexar um seringa pré-carregada com 1 mL de meio de crescimento (79% de RPMI, FBS 20%, 1% de penicilina estreptomicina) e perfundir em microtubo, recolha de efluente em cultura de tecidos bem tratados placa. Células de cultura a 37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificado. 6. Os resultados representativos O objectivo desta técnica consiste em isolar as células cancerosas viáveis ​​a partir do sangue de pacientes com cancro. Existem vários métodos para identificar as células cancerosas em cultura; uma verificação necessária de sucesso dispositivo. Nós escolhemos para corar as células em cultura com anticorpos contra porções epiteliais, tais como EpCAM (molécula de adesão celular epitelial) ou PSMA (próstata antigénio de membrana específica), além de DAPI para identificar núcleos de células intactas (Fig. 2 e 3). O número de células cancerosas capturado usando esta técnica é necessariamente uma função do número de CTC na amostra de partida, e variabilidade paciente pode ser elevado. No processamento de amostras colhidas de pacientes diagnosticados com câncer em estágio IV, que rotineiramente capturar entre 100 e 500 células cancerosas por tubo de sangue, com pureza> 50%. Imediatamente após o isolamento, um maior número de leucócitos contaminantes podem estar presentes. No entanto, estes números será esgotada de incubação a seguir no meio de cultura para até 5 dias. <strong> Figura 1. esquemático de microtubo funcionalizado para CTC isolamento, mostrando-selectina mediada circulante seguido por mediada por anticorpo de adesão estática. Figura 2. Dados representativos de isolamento CTC a partir de amostras de sangue colhido de uma paciente com câncer de mama e um paciente com câncer de pulmão. O número de células viáveis ​​positivamente identificados como CTC com base na coloração de EpCAM é representada pelas barras sólidas e pertencem à ordenadas da esquerda e da percentagem de células que foram identificados como CTC em comparação com o número total de células capturadas é representada pelas barras abertas e medido na ordenada a direita. Os resultados são depois de cinco dias em cultura. Figura 3. Micrografias representativos de dadores separadas (A e B) de CTC em cultura de 5 dias subsequentes para isolatiem a partir de uma amostra de sangue do cancro do paciente. As células foram coradas com fluorescência para EpCAM com AlexaFluor 488 (verde) e 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar o núcleo (azul).