Snelle Isolatie van Viable circulerende tumorcellen van de patiënt Blood Samples

Het volgende protocol is voor de productie van een microbuisjes apparaat. 1. Voorbereiding van halloysiet Nanotube Solution Bewerk met ultrasone trillingen (10-13 W (rms)) 250 il halloysiet nanobuis oplossing (6,6 gew% in water) 30 sec. Cool oplossing met koud water en herhaal sonicatie een keer. Laat weer afkoelen. Teken gesoniceerde oplossing in een spuit, sluit een 0,45 pm spuitfilter, en filter oplossing in schone microfugebuis. Vortex de oplossing af tot homogeniteit te handhaven. 2. Coating van microbuisjes de binnenkant met halloysiet nanobuisjes Zorg voor 50 cm lange sectie van micro-Renathane microtubing (300 micrometer inwendige diameter, 35,3 pl innerlijke volume). Snijd het ene uiteinde van de microbuisjes op een diagonaal en in te voegen in een klein IDEX adapter stuk. Steek de naald van een 3/10 cc 29g spuit in de andere uiteinde van de microbuisjes. Om de microbuisjes schoon te maken, plaatst u het open uiteinde van microbuisjes (het eindemet de adapter) in 70% ethanol en gelijkspel ~ 50 pl ethanol in de spuit om microbuisjes te vullen. Spoel de ethanol uit de microbuisjes door het tekenen van een royale hoeveelheid gedestilleerd water in de spuit. Maak de spuit van de microbuisjes, het legen van de spuit, en dan vast aan de microbuisjes. Een oplossing van 0,02% w / v poly-L lysine in water. Trek 50 pL de microbuisjes en laat hem 5 min bij kamertemperatuur (RT). Teken 100 ul gefilterd nanobuis oplossing in de microbuisjes en laat incubeer gedurende 3 minuten bij RT. Teken 100 ul water door de microbuisjes te spoelen de nanobuis oplossing. Laat gecoat microbuisjes te zitten, gevuld met water, 's nachts bij kamertemperatuur. 3. Voorbereiding van microbuizen voor celisolatie Een oplossing van 10 pg / ml proteïne G in fosfaat 1X Dulbecco's gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,0 – 7,2). Teken 50 pL PBS door microbuisjes en teken dan 50 pihet eiwit-G oplossing en laat gedurende 1,5 uur incuberen bij kamertemperatuur. Bereid een oplossing van 5 ug / ml E-selectine-IgG en 50 ug / ml antilichaam (anti-EpCAM meeste carcinoom, anti-PSMA voor prostaatkanker monsters) in PBS. Trek 50 ul van de E-selectine antilichamen oplossing in de microbuisjes en laat gedurende 2 uur incuberen bij kamertemperatuur. Specifieke cellulaire hechting geblokkeerd met 5% melkeiwit. Een oplossing van 5% (w / v) melkeiwit in PBS. Trek 50 pL melkeiwit oplossing in de microbuisjes en laat gedurende 1 uur incuberen bij kamertemperatuur. Teken 50 ul PBS in de buis en laat bij kamertemperatuur tot bloed-of buffy coat monsters zijn klaar voor verwerking. 10 minuten voorafgaand aan het gebruik van de microbuisjes voor isolatie, trekken 50 ul PBS die is verzadigd met Ca 2 + ("PBS +") om de selectine moleculen te activeren. 4. Bereiding van monsters celisolatie Teken of 10 ml bloed te verkrijgen van de patiënt in gehepariniseerdebuis. Breng 10 ml Ficoll-Paque lymfocyten isolatie-oplossing in 50 ml centrifugebuis. Voorzichtig laag 10 ml totaal bloed op Ficoll zodat geen bloed en Ficoll mengen. Centrifugeer bij 2000x g gedurende 15 min bij 4 ° C met minimale vertraging. Verwijder de buffy coat laag en plaats in de nieuwe buis. Was de buffy coat met PBS (centrifugeer bij 230x g gedurende 10 min, schenk de bovenstaande). Voorzichtig mengen cellen met 1 ml RBC lysisbuffer en geïncubeerd 10 min bij kamertemperatuur aan erythrocyten lyseren. Voeg 10 ml PBS, meng voorzichtig en centrifugeer bij 230x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en voorzichtig de pellet opnieuw in suspensie in 3 tot 4 ml PBS +. 5. Celisolatie Het ene uiteinde van het gefunctionaliseerde microbuisjes een 5 ml gebruikt IDEX adapters. Plaats de spuit op een injectiepomp. Dompel het open uiteinde van de gefunctionaliseerde microbuisjes in de cel suspension. Werkwijze de celsuspensie door microbuisjes op 1 tot 4 mL / uur. Breng het open uiteinde van de microbuisjes een buis met PBS + en stelt 300 ul PBS + in de injectiespuit bij 0.016 ml / min om ongebonden en losjes cellen uit de microbuisjes. De open uiteinde van de microbuisjes in een schone buis. Haal de spuit uit de microbuisjes en bevestig een spuit voorgevuld met Accutase. Voorzichtig doorstroomd voldoende Accutase in de microbuisjes vullen (~ 50 pi) en laat bij kamertemperatuur incuberen gedurende 10 minuten. Maak een spuit voorgevuld met 1 ml van de groei media (79% RPMI, 20% FBS, 1% penicilline streptomycine) en perfuseren in microbuisjes, het verzamelen van afvalwater in weefselkweek goed behandeld plaat. Kweekcellen bij 37 ° C en 5% CO2 onder vochtige omstandigheden. 6. Representatieve resultaten Het doel van deze techniek is levensvatbare kankercellen isoleren uit het bloed van patiënten met kanker. Er bestaan ​​verschillende manieren om kankercellen te herkennen in cultuur; een noodzakelijke controle van het apparaat succes. We hebben gekozen cellen in kweek vlek met antilichamen tegen epitheliale groepen zoals EpCAM (epitheliale cellulaire adhesie molecule) of PSMA (prostaat-specifiek antigen membraan) naast DAPI intacte celkernen (Fig. 2 en 3) bepalen. Het aantal kankercellen opgenomen met deze techniek noodzakelijk een functie van het aantal CTC in de uitgangsmonster en variabiliteit kan hoog zijn. Bij de verwerking monsters van patiënten met kanker fase IV wij routinematig vangen tussen 100 en 500 kankercellen per buis bloed op zuiverheid> 50%. Onmiddellijk na isolatie, kan een groter aantal van besmetting van leukocyten aanwezig zijn. Maar deze aantallen wordt uitgeput volgende incubatie in kweekmedium voor maximaal 5 dagen. <strong> Figuur 1. Schematische voorstelling van gefunctionaliseerde microbuisjes voor CTC isolatie, met selectine-gemedieerde rollen, gevolgd door antilichaam-gemedieerde statische hechting. Figuur 2. Vertegenwoordiger gegevens van CTC isolatie van bloedmonsters van een borstkanker patiënt en een longkanker patiënt. Het aantal levensvatbare cellen geïdentificeerd als CTC op EpCAM kleuring wordt vertegenwoordigd door de vaste staven en hebben betrekking op de linker coördineren en het percentage cellen werden geïdentificeerd als CTC vergelijking met het totale aantal cellen opgenomen wordt vertegenwoordigd door de open staven en gemeten rechts ordinaat. De resultaten worden vijf dagen in kweek. Figuur 3. Representatieve microfoto van verschillende donoren (A en B) van CTC in cultuur 5 dagen na het isolativerlengde van een kankerpatiënt bloedmonster. Cellen werden fluorescerend gekleurd EpCAM met AlexaFluor 488 (groen) en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) van de kern (blauw) zichtbaar.