Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

Das folgende Protokoll ist für die Herstellung eines einzelnen Mikroröhre Vorrichtung. 1. Vorbereitung von Halloysit Nanotube-Lösung Sonifikat (10-13 W (rms)) 250 ul Halloysit-Nanoröhrchen-Lösung (6,6 Gew.% in Wasser) 30 sek. Coole Lösung mit kaltem Wasser und wiederholen Sie die Beschallung einmal. Wieder cool. Zeichnen Sie beschallten Lösung in eine Spritze, legen Sie eine Spritze 0,45 um-Filter und Filter-Lösung in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Lösung gelegentlich bis zur Homogenität aufrechtzuerhalten. 2. Beschichtung von Reaktionscup innere Oberfläche mit Halloysit-Nanoröhren Erhalten 50 cm langen Abschnitt der Micro-Renathane microtubing (300 mu m Innendurchmesser, 35,3 ul Innenvolumen). Schneiden Sie ein Ende des Mikroröhrchen bei einer Diagonale und stecken in einem kleinen IDEX Adapterstück. Führen Sie die Nadel von einem 3/10 cc 29G Spritze in das andere Ende des Mikroröhrchens. Um die Mikroröhrchen reinigen, legen Sie das offene Ende des Mikroröhrchen (das Endemit dem Adapter) in 70% Ethanol und Auslosung ~ 50 ul Ethanol in die Spritze zu füllen Mikroröhrchen. Spülen Sie das Ethanol aus dem Mikroröhrchen, indem ein großzügiges Volumen von destilliertem Wasser in die Spritze. Lösen Sie die Spritze aus dem Mikroröhrchen, entleeren Sie die Spritze, und dann wieder an die Mikroröhrchen. Eine Lösung aus 0,02% w / v Poly-L-Lysin in Wasser. Zeichnen Sie 50 ul in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zu sitzen. Zeichnen Sie 100 ul gefiltert Nanotube-Lösung in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 3 min bei RT inkubieren. Zeichnen Sie 100 ul Wasser durch die Mikroröhrchen zum Ausspülen des Nanotube-Lösung. Erlauben beschichteten Mikroröhrchen zu sitzen, mit Wasser gefüllt, über Nacht bei RT. 3. Vorbereitung der Mikroröhrchen zur Zellisolierung Eine Lösung aus 10 ug / ml Protein G in 1X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0 – 7,2). Zeichnen Sie 50 ul PBS durch Mikroröhrchen und zeichnen Sie dann 50 uldas Protein-G-Lösung und zu ermöglichen, für 1,5 h bei RT inkubiert. Bereiten Sie eine Lösung mit 5 ug / ml E-Selektin-IgG und 50 pg / ml Antikörper (anti-EpCAM für die meisten Krebs-Proben, anti-PSMA für Prostatakrebs-Proben) in PBS. Zeichnen Sie 50 ul der E-Selektin und Antikörper-Lösung in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 2 h bei RT inkubieren. Unspezifische zelluläre Adhäsion wird mit 5% Milch-Protein blockiert. Eine Lösung aus 5% (w / v) Milchprotein in PBS. 50 ul Malen Milchprotein Lösung in die Mikroröhre und lassen für 1 Stunde bei RT inkubiert. Zeichnen Sie 50 ul PBS in das Rohr und lassen bei RT, bis Blut oder Buffy-Coat-Proben für die Verarbeitung bereit sind. 10 min vor der Verwendung des Mikroröhrchen für Isolation, ziehen 50 ul PBS, die mit Ca 2 + ("PBS +") gesättigt wurde, um die Selektin-Moleküle aktivieren. 4. Vorbereitung der Proben für Zell-Isolierung Zeichnen oder erhalten 10 ml Blut von Patienten in heparinisierteRohr. 10 ml Ficoll-Paque Lymphozytenisolation Lösung in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Vorsichtig Schicht 10 ml Vollblut auf Ficoll, um nicht zu mischen, das Blut und Ficoll. Zentrifugieren bei 2000 x g für 15 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung. Entfernen Sie die Buffy-Coat-Schicht und in neues Röhrchen. Wash Buffy-Coat mit PBS (Zentrifuge bei 230x g für 10 min, den Überstand verwerfen). Vorsichtig resuspendieren Zellen mit 1 ml RBC Lysispuffer und Inkubation für 10 min bei RT, um Erythrozyten zu lysieren. Fügen Sie 10 ml PBS, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 230x g für 10 min. Überstand verwerfen und das Pellet vorsichtig in 3 bis 4 ml PBS +. 5. Zellisolierung Befestigen Sie ein Ende des funktionalisierten Mikroröhrchen auf eine 5 ml Spritze mit IDEX-Adapter. Legen Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe. Tauchen des offenen Endes des funktionalisierten Mikroröhre in die Zelle suspension. Verarbeiten Sie die Zellsuspension durch die Mikroröhrchen bei 1 bis 4 ml / h. Übertragen des offenen Endes der Mikroröhrchen in ein Röhrchen mit PBS + und stellt 300 ul PBS + in die Spritze mit 0,016 ml / min, um ungebundene und lose gebundenen Zellen aus dem Mikroröhrchen entfernen. Platzieren Sie das offene Ende des Mikroröhrchens in ein sauberes Röhrchen. Trennen Sie die Spritze aus dem Mikroröhrchen und fügen Sie eine Spritze mit Accutase vorgefüllt. Vorsichtig genug perfundieren Accutase in die Mikroröhrchen zu füllen (~ 50 ul) und lassen Sie sie bei RT für 10 min inkubieren. Befestigen Sie eine Spritze mit 1 ml Wachstumsmedium (79% RPMI, 20% FBS, 1% Penicillin Streptomycin) und perfuse in Mikroröhrchen vorgefüllt, Sammeln Abwässer in Gewebekultur behandelt Well-Platte. Kultur Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 unter Bedingungen befeuchtet. 6. Repräsentative Ergebnisse Das Ziel dieser Technik ist, um lebensfähige Krebszellen aus dem Blut von Krebspatienten zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden, um Krebszellen in Kultur zu identifizieren; eine notwendige Überprüfung des Gerätes Erfolg. Wir haben uns entschieden, Zellen in Kultur mit Antikörper gegen epitheliale Einheiten, wie EpCAM (epithelialen zelluläre Adhäsionsmolekül) oder PSMA (Prostata-spezifisches Membran-Antigen) zu färben, zusätzlich zu DAPI, um intakte Zelle Kerne (Abb. 2 und 3) zu identifizieren. Die Anzahl der Krebszellen aufgenommen unter Verwendung dieser Technik ist notwendigerweise eine Funktion der Anzahl von CTC in der Ausgangsprobe und Patienten-Schwankung kann hoch sein. Bei der Verarbeitung von Patienten mit Krebs diagnostiziert Stadium IV getroffen, wir routinemäßig zu erfassen zwischen 100 und 500 Zellen pro Röhrchen Krebs von Blut, mit einer Reinheit> 50%. Unmittelbar nach der Isolierung, kann eine größere Anzahl von kontaminierenden Leukozyten vorhanden sein. Allerdings sind diese Zahlen werden nach Inkubation in Kulturmedium für bis zu 5 Tage abgereichert werden. <strong> Abbildung 1. Schematische Darstellung des funktionalisierten Mikroröhrchen für CTC Isolation, zeigt Selektin-vermittelte Rollen durch Antikörper-vermittelte statische Haftung gefolgt. Abbildung 2. Repräsentative Daten von CTC Isolierung aus Blutproben aus einer Brustkrebs-Patienten und einem Patienten mit Lungenkrebs gezeichnet. Die Zahl der lebensfähigen Zellen als positiv identifiziert CTC auf EpCAM-Färbung bezogen wird durch die festen Stäbe und beziehen sich auf die linke Ordinate und der Prozentsatz der Zellen, die identifiziert wurden dargestellt, wie CTC der Gesamtzahl der gefangenen Zellen im Vergleich wird durch die offene Balken dargestellt und gemessen auf der rechten Ordinate. Die Ergebnisse werden nach fünf Tagen in Kultur. Abbildung 3. Vertreter Aufnahmen von verschiedenen Spendern (A und B) von CTC in Kultur 5 Tage im Anschluss an isolatiauf von einem Krebspatienten Blutprobe. Die Zellen wurden bei EpCAM Fluoreszenz mit AlexaFluor 488 (grün) und 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt, um den Kern (blau) zu visualisieren.