Этот протокол описывает использование тангенциального потока полые волокна ультрафильтрации система концентрации образца и тепло диссоциации в качестве альтернативных шагов для обнаружения водной<em> Cryptosporidium</em> И<em> Giardia</em> Вид с использованием EPA Method 1623 году.
Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better characterize the prevalence of these pathogens, EPA Method 1623 was developed and used to monitor levels of these organisms in US drinking water supplies 12. The method has three main parts; the first is the sample concentration in which at least 10 L of raw surface water is filtered. The organisms and trapped debris are then eluted from the filter and centrifuged to further concentrate the sample. The second part of the method uses an immunomagnetic separation procedure where the concentrated water sample is applied to immunomagnetic beads that specifically bind to the Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts allowing for specific removal of the parasites from the concentrated debris. These (oo)cysts are then detached from the magnetic beads by an acid dissociation procedure. The final part of the method is the immunofluorescence staining and enumeration where (oo)cysts are applied to a slide, stained, and enumerated by microscopy.
Method 1623 has four listed sample concentration systems to capture Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), or Continuous Flow Centrifugation (Haemonetics, Braintree, MA). However, Cryptosporidium and Giardia (oo)cyst recoveries have varied greatly depending on the source water matrix and filters used1,14. A new tangential flow hollow-fiber ultrafiltration (HFUF) system has recently been shown to be more efficient and more robust at recovering Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from various water matrices; moreover, it is less expensive than other capsule filter options and can concentrate multiple pathogens simultaneously1-3,5-8,10,11. In addition, previous studies by Hill and colleagues demonstrated that the HFUF significantly improved Cryptosporidium oocysts recoveries when directly compared with the Envirochek HV filters4. Additional modifications to the current methods have also been reported to improve method performance. Replacing the acid dissociation procedure with heat dissociation was shown to be more effective at separating Cryptosporidium from the magnetic beads in some matrices9,13 .
This protocol describes a modified Method 1623 that uses the new HFUF filtration system with the heat dissociation step. The use of HFUF with this modified Method is a less expensive alternative to current EPA Method 1623 filtration options and provides more flexibility by allowing the concentration of multiple organisms.
Тангенциальный поток полые волокна ультрафильтрации является альтернативным и эффективный метод для начальной концентрации ооцист Cryptosporidium и Giardia кист из воды. Полые волокна ультрафильтрации дешевле, чем традиционные фильтры. Поскольку у него есть способность к концентрации ооцист Cryptosporidium и Giardia кист различных матриц воде является полезной альтернативой современные методы фильтрации для EPA Method 1623 году. Как и в большинстве других методов фильтрации, полые волокна ультрафильтрации подвержены загрязнению с очень мутной образцов. Высокое давление воды может возникнуть в результате загрязнения фильтра, поэтому он рекомендуется для контроля давления при фильтрации перспективе. В дополнение к Cryptosporidium и Giardia ооцист кисты, полые волокна ультрафильтрации было показано, что способен концентрировать бактерии и вирусы 1-3,5,8. Полые волокна ультрафильтрации оutlined в этот метод может быть использован для нескольких организмов концентрировать в одном образце. Стоит отметить, что получение конечного объема от 200 до 250 мл является критической последний шаг в концентрации процедуры, чтобы дополнительные шаги, центрифугирования, которые могут привести к (оо) кисты потери можно избежать (шаг 2.2). Тем не менее, благодаря чему объем в бутылке падает слишком низко может иметь неблагоприятное воздействие на восстановление, так как не будет достаточного объема жидкости, чтобы заставить всех ооцист или кисты в ретентат бутылку. Поэтому рекомендуется поддерживать конечный объем от 200 до 250 мл.
Тепло диссоциации является альтернативой кислоты шаг диссоциации Метод 1623. Этот альтернативный шаг приводит к улучшению восстановления ооцист Cryptosporidium и уменьшить метод изменения, когда изолированы от любой реке или реагентом вода 9. Бок о бок сравнение кислоты и тепловой диссоциации методов показали, что использование тепла диссоциациите организмы из бисера иммуномагнитных производства выше средних возмещений для Cryptosporidium и Giardia. Кроме того, точность Cryptosporidium и Giardia восстановление было лучше в образцах, обработанных с тепловой диссоциации по сравнению с кислотной диссоциации 9.
Включение HFUF как концентрация шаг позволяет более гибко, предоставляя возможность сконцентрироваться нескольких организмов. Кроме того, он является менее дорогой альтернативой текущим Метод 1623 вариантов фильтрации.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Энн и Майкл Гримм Циммерман для критического обзора этой рукописи и Дуг Гамильтон за его техническую поддержку.
Equipment/Reagent | Vendor | Catalog # |
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R |
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole Parmer | EW-06408-73 |
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-24 |
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-15 |
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-36 |
I/P Precision Brushless Drive | Cole Parmer | EW-77410-10 |
I/P Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-77601-10 |
Black HDPE Tee, 1/4″x 3/8″ x 3/8″ | US Plastics | 62064 |
Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole Parmer | EG-30613-12 |
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole Parmer | EW-06257-10 |
10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C |
Nalgene filling/venting cap for 1/4″ tubing, 53B | Cole Parmer | EW-06258-10 |
Pressure gauge | Cole Parmer | A-680-46-10 |
Straight coupling, NPT(F), 1/4″ | Cole Parmer | EW-06469-18 |
NPT branch tee, natural pp | Cole Parmer | A-30610-75 |
Pinch clamps, 1/2″ | Cole Parmer | EW-06833-00 |
Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 |
Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B |
Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q |
Keck ramp clamp, 14mm | Cole Parmer | EW-06835-10 |
Sodium polyphosphate | Sigma Aldrich | 305553 |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | 72050 |
Antifoam Y-30 emulsion | Sigma Aldrich | A5758 |
Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 |
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR | IR314-0025 |
Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 |
250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 |
Disposable funnel | Cole Parmer | U-6122-10 |
Wash bottle | Cole Parmer | U-06252-40 |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ARIES SX4750 |
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter | 349849 |
200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 |
VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 |
5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D |
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 |
50 ml conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 |
Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 |
Timer | VWR | 23609-202 |
Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D |
1 ml pipettes | VWR | 53283-700 |
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 |
1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P1000/DF1000ST |
100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P100/DF100ST |
9 inch Pasteur pipettes | VWR | 14672-412 |
Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D |
Vortex | VWR | 14216-188 |
Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 |
Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 |
Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 |
Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 |
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma | P4417 |
Single Spot slides | IDEXX | 30201 |
Cover glass | Corning | 287018 |
EasyStain direct kit | BTF | – |
10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P10 & DF10ST |
4′,6′-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 |
Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 |
Methanol | Fisher Scientific | L6815 |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 |
Incubator | Boekel Scientific | 133000 |
slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 |
Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon | MXA20234 |
Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon | MBA 77000 |
Plan APO 100X oil objective | Nikon | MRD01901 |
Plan Achro 20X | Nikon | MRL00202 |
FITC filter | Nikon | 96302 |
DAPI filter | Nikon | 96301 |
X-cite fluorescence illuminator | Nikon | 87540 |
Lens paper | Nikon | 76997 |
Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D |
Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 |
3 % hydrogen peroxide | VWR | BDH3540-2 |
Bleach | Fisher Scientific | 1952030 |
Wypall | Kimberly Clark | 34790 |