Un metodo modificato EPA 1623 che utilizza flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione e di calore passi dissociazione per rilevare Waterborne<em> Cryptosporidium</em> E<em> Giardia spp.</em

1. Flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione procedura Preparazione di tamponi e soluzioni: Soluzione di eluizione (1 L): Per aggiungere 1 L di acqua distillata polifosfato di sodio 0,1 g, 0,1 ml di Tween-80 e 0,01 ml Y-30 antischiuma. Preparare gruppo filtro (figura 1) in una cappa di sicurezza biologica: Inserire Masterflex I / P 73 attraverso un tubo lab I / P Masterflex Easy-Load testa della pompa collegata ad un I / P brushless Masterflex unità di precisione. Fissare la tubatura a un, glicerina 0-60 psi-riempita manometro munito di un ramo NPT connettore a T a monte della testa della pompa con un morsetto a vite, e ad un connettore a T HDPE a valle della testa della pompa. Montare la bottiglia ritentato montando un Nalgene 53-B di riempimento / sfiato tappo con Masterflex L / S 15 tubi di laboratorio e di un connettore a T e fissandolo ad una bottiglia da 1 L heavy duty polipropilene Nalgene. Montare Masterflex L / S 24 tubi won una fascetta pizzico (pizzico morsetto 2) e collegarlo dalla bottiglia retentato al HDPE T-connettore. Collegare L / S Masterflex tubo 24 laboratorio dal manometro al Asahi Kasei Rexeed 25S alto flusso dializzatore con un morsetto a vite, e dal dializzatore alla bottiglia ritentato. Utilizzare misura adattatori DIN progettati per ospitare ¼ "tubo ID per collegare il tubo al ultrafiltro a fibre cave. Montare Masterflex L / S 24 tubi di laboratorio con una fascetta pizzico (pizzico morsetto 1) e collegarlo a una pipetta di plastica da 10 ml con il tappo di punta e cotone rimosso per agire come la linea di assorbimento del campione e quindi collegare il tubo al HDPE T- connettore. Inserire un'estremità del tubo Masterflex L/S-36 laboratorio con una rampa fissacavo e collegare il tubo alla porta effluenti situato vicino alla estremità di uscita del filtro. Posizionare l'altra estremità nel contenitore di rifiuti. Aggiungere 0,01% (w / v) polifosfato di sodio al campione 10 L di acqua e miscelare per 3 min. Chiudere il morsetto pizzico 2e rimuovere il tappo di chiusura dal flacone ritentato. Tutti gli altri morsetti dovrebbe essere aperta. Impostare la direzione della pompa per spostare il fluido dal connettore a T per il manometro (da destra a sinistra seguente Figura 1). Regolare la velocità della pompa al 25% della velocità massima e accendere la pompa. Quando la bottiglia retentato è di 2/3, morsetto pizzico aperto 2 e sostituire rapidamente il tappo di chiusura alla bottiglia ritentato. Controllare tutte le linee e raccordi per garantire non vi siano perdite. Aumentare lentamente la velocità della pompa alla velocità di filtrazione desiderata (circa 1,5 L / min), controllando eventuali perdite. Utilizzo di un cilindro graduato e un misuratore di flusso o timer, controllare la portata del filtrato dell'acqua in uscita dalla linea di effluente (blu L / S tubo 36 nella figura 1). Le bolle d'aria possono tipicamente formano all'estremità di uscita del filtro rende difficile raggiungere una pressione stabile e la velocità di filtrazione. Questo è stato corretto pizzicando la linea di effluenti a mano per un momento. Questa azionegeneralmente coassiale la bolla d'aria alla porta e filtrato per uscire attraverso la linea effluente. Ripetere, se necessario, tenendo presente che le bolle d'aria pisello dimensioni sono spesso inevitabili. Monitorare il processo di filtrazione. Misurare e registrare la pressione e la velocità di filtrazione come necessario. La pressione non deve mai superare i 20 psi. Si raccomanda che la velocità di filtrazione non deve superare 2,0 L / min. È importante che il volume di acqua nella bottiglia retentato essere monitorate per assicurare che non si svuota. È normale che il volume per aumentare o diminuire leggermente. Se il volume di acqua in bottiglia retentato scende sotto 1/3, quindi rimuovere il tappo di chiusura e un pizzico Chiudere il morsetto 2 sulla linea delle bottiglie ritentato. Portare il volume torna a circa 2/3, aprire il morsetto e sostituire rapidamente il tappo di chiusura, garantendo una tenuta perfetta. Se il volume in bottiglia retentato scende velocemente e, quindi assicurarsi il coperchio bottiglia ritenuto è stretto e il tappo di sfiato è saldamente in posizione, e che l'tubing è ancora in contatto con il campione di acqua. Se questi problemi non si verificano, allora è probabile che la guarnizione del coperchio bottiglia ritentato è male e deve essere sostituito. Quando il contenitore del campione è vuoto, morsetto presa immediatamente chiuso 1, ridurre la velocità della pompa al 20% del massimo, togliere il tappo di chiusura dal flacone ritentato e chiudere il morsetto rampa. Regolare il volume del campione in bottiglia retentato a circa 200 ml svitando o avvitando il morsetto rampa. Dopo che il volume è di circa 200 ml, stringere il morsetto rampa per le fasi di eluizione (1,11-1,12). Aggiungere 500 ml di soluzione di eluizione per il contenitore del campione e lavare l'interno del contenitore. Posizionare la pipetta 10 ml collegato alla linea di assorbimento del campione nel contenitore che contiene la soluzione di eluizione. Assicurarsi che il morsetto rampa è chiuso. Aperto pizzico morsetto 1 e un pizzico vicino morsetto 2 momentaneamente di elaborare la soluzione di eluizione. Dopo 500 ml di soluzione di eluizione è redatta, Vicino pizzico morsetto 1 e il morsetto pizzico aperto 2. Lasciare la soluzione di eluizione di circolare per 5 minuti con una velocità della pompa del 20% del massimo. Regolare il volume del campione in bottiglia retentato a circa 100 ml svitando o avvitando il morsetto rampa sulla linea di effluenti. Serrare la fascetta rampa e permettere al campione di circolare per 1 minuto. Evitare di tirare l'aria nel tubo garantendo il volume del campione nella bottiglia retentato è sufficiente a coprire la L / S 15 di entrare nel tubo bottiglia ritentato. Invertire la direzione della pompa che costringe il campione nella bottiglia ritentato. Lasciare la pompa per la retromarcia per 20 secondi per un totale di ~ 225 ml in bottiglia retentato. Spegnere la pompa. Rimuovere l'I / P Masterflex 73 tubo dalla testa della pompa e scollegare il manometro. Scollegare il L / S Masterflex 24 tubi uscita dalla fibra cava ultrafiltro. Tenere il tubo sopra la bottiglia ritenuto di forzare qualsiasi campione rimanente nellaritentato bottiglia. Scollegare tutti i tubi dalla bottiglia e sostituire il tappo di sfiato con un non-sfiato tappo. Proseguire fino alla IMS / IFA procedura con il retentato ~ 225 ml. 2. Separazione Procedura immunomagnetica Preparazione di tamponi e soluzioni: Lasciare i tamponi inclusi nelle Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit a temperatura ambiente. 1X SL-buffer A: Aggiungere 1 ml di 10X SL-buffer A a 9 ml di acqua distillata. Trasferire la ~ 225 ml di liquido dalla bottiglia a un ritentato etichettato 250 ml provetta da centrifuga conica. Risciacquare la bottiglia ritentato due volte con 10 ml di acqua distillata, e aggiungere i risciacqui al tubo da centrifuga conica. Centrifugare la sospensione a 1500 xg per 15 min a 4 ° C senza freno. Aspirare il supernatante dal aria-acqua a 5 ml di sopra della imballato pellet per ogni 0,5 ml di volume pellet (cioè aspirato a 15 ml sopra un volume di 1,3 ml pellet, e aspirare a 5 ml di una pastiglia di 0,5 ml o meno). Accuratamente risospendere il pellet nel surnatante tramite vortex e / o una pipetta di miscelazione. Trasferire ogni volume di 5 ml di liquido al piatto lati Dynal L10 provetta contenente 1 ml ciascuna di SL-10X e 10X tampone A SL-tampone B. Lavare il tubo conico centrifuga due volte con 2,5 ml di acqua distillata e aggiungere la risciacquatura il tubo L10, portando il volume totale del tubo ml L10 a 12, compresi i buffer. Aggiungere 100 ul ciascuno di Dynabeads risospeso ben miste anti-anti-Cryptosporidium e Giardia al tubo L10. Ruotare il tubo L10 a 18 rpm per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore rotatore. Posizionare il lato piatto del tubo L10 contro l'MPC-6 magnete e rock delicatamente a mano il tubo end-to-end, a 180 ° per 2 minuti. Mantenere il tubo L10 del MPC-6 magnete con il lato magnete alto, decantare il surnatante dal tallone / (oo) cisti complessi bound al magnete. Rimuovere il tubo L10 del magnete e aggiungere 0,5 ml di tampone 1X SL-A al tubo. Trasferire la sospensione con due risciacqui supplementari di 0,5 ml di SL-1X tampone A in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml tenuto in MPC-S con il magnete in posizione verticale. Agitare delicatamente il tubo nel MPC-S magnete a 180 ° per 1 minuto. Con il magnete in posizione, aspirare il supernatante usando una pipetta Pasteur diretta al fondo della provetta. Aggiungere 1 ml di 1X PBS al lato anteriore della provetta, rimuovere il magnete e oscillare delicatamente il tubo fino a quando le perle vengono risospese. Sostituire il magnete in posizione verticale e oscillare delicatamente il tubo 180 ° per 1 minuto. Aspirare il PBS risciacquo, senza disturbare il pellet tallone, utilizzando una pipetta Pasteur per rimuovere quanto più possibile i detriti. Rimuovere il magnete e aggiungono 50 pl di acqua distillata al lato posteriore della provetta. Vortex il tubo a tutta velocità per 50 secondi,incubare il tubo a 80 ° C per 10 minuti seguiti da un vortice 30 secondi. Sostituire il magnete nella MPC-S in posizione inclinata, legando le perline al magnete e lasciando i (oo) cisti nel liquido. Applicare il (oo) sospensione cisti a una diapositiva SingleSpot bene. Ripetere passo 2,10, applicando il liquido stesso pozzo contenente la dissociazione prima. Vetrino su uno scivolo 37 ° C per 1 ora calda per asciugare la sospensione al vetrino. 3. Colorazione ed esame Preparazione di tamponi e soluzioni: Soluzione di lavoro DAPI: Aggiungere 25 ml di soluzione DAPI magazzino (2 mg / ml in metanolo) a 25 ml di PBS 1X. Negozio di stock e le soluzioni di lavoro tra 1 ° C e 10 ° C al buio. Applicare 50 pl di metanolo alla slitta bene e lasciare asciugare a temperatura ambiente. Aggiungere 50 pl della soluzione di DAPI lavoro alla slitta pozzetto ed incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare un Kimwipe per Wick il DAPI dal pozzo. Applicare il 50 microlitri di EasyStain. Incubare a 35 ° C per 30 minuti. Wick la macchia del bene con un Kimwipe, e poi aggiungere lentamente 300 ml di tampone di fissaggio a freddo EasyStain, permettendogli di scendere oltre il bordo bene. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare un Kimwipe a Wick il buffer dal pozzo e applicare 10 pl di medio EasyStain di montaggio. Con attenzione applicare un vetrino, eliminando eventuali bolle che si verificano. Sigillare il coprioggetto con smalto trasparente. Scansione l'intera diapositiva utilizzando il filtro FITC, con ingrandimento 200X totale, per ovoidale o sferica oggetti fluorescenti verde mela che assomigliano a uno oocisti o cisti. Esaminare tutti gli oggetti con il filtro DAPI a 1000X ingrandimento totale e poi con DIC, anche a 1000X ingrandimento totale. Registrare il formato utilizzando un micrometro oculare calibrato e caratteristiche morfologiche. Risultati del documento. Nota: Ulteriori informazioniinformazioni sulla procedura originale si trova nella versione di dicembre 2005 di metodo EPA 1623 12. Il flusso tangenziale a fibre cave ultrafiltrazione procedura descritta viene utilizzata al posto della sezione di 12,0 metodo EPA 1623. La dissociazione di calore modifica la sezione 13.3.3 del metodo EPA 1623. La procedura descrive anche un ulteriore risciacquo PBS durante il processo di IMS che può essere inserito nella versione del dicembre 2005 Method 1623 dopo la sezione 13.3.2.16. L'elenco completo dei beni di consumo, reagenti e attrezzature utilizzati per il metodo EPA 1623 l'inserimento di tali modifiche è elencato nella lista degli equipaggiamenti. 4. Risultati rappresentativi Oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia recuperati attraverso i processi di filtrazione e separazione immunomagnetica sono rilevati da analisi microscopica. A 200X ingrandimento totale, ogni organismo esibendo un tipico schema di colorazione, dimensione, forma e come mostrato in figura 2 </strong> dovrebbe essere ulteriormente osservare con olio da immersione a 1000X ingrandimento totale. Ciò consentirà la misurazione e l'identificazione di una delle caratteristiche tipiche che definiscono o caratteristiche atipiche che escludono l'identificazione positiva. Cryptosporidium è un oggetto sferico ovoidale per 4 a 6 micron di diametro che presenta una brillante fluorescenza verde mela con bordi FITC brillantemente evidenziato (Figura 3A ). Con DAPI UV, uno oocisti esporrà una delle seguenti categorie tipiche funzionalità: la luce interna colorazione blu con bordo verde e senza nuclei distinti (DAPI negativo), intensa colorazione blu interno, o fino a quattro distinti, sky-blue nuclei (DAPI positivo – Figura 3B). Caratteristiche atipiche includono deviazioni di colore, struttura, o fluorescenza DAPI (ad esempio, troppi nuclei tinto, rosso fluorescente strutture interne). Se l'oggetto fluorescente ha soddisfatto i criteri per FITC tipico e colorazione DAPI, è esaminato tramite le interferenze con differenzialecontrasto (DIC). L'oggetto viene esaminato per atipici caratteristiche esterne o interne morfologici come ornamento parete cellulare, o uno o due nuclei grandi riempimento della cella. Se le strutture atipici non si osservano, l'oggetto viene registrata nel totale IFA e classificati come una struttura amorfa o vuoto con uno a quattro sporozoiti presenti (Figura 3C). Allo stesso modo, Giardia oggetti simili vengono esaminati per quanto riguarda la colorazione FITC e DAPI così come le caratteristiche di CID, come assonemi, corpi mediani e nuclei cisti di Giardia sono rotonde ad oggetti ovoidali brillanti mela verde, 8 – 18 micron di lunghezza per 5 – 15 um ampio con bordi brillantemente evidenziato (Figura 3D). Con DAPI UV, la cisti Giardia esporrà DAPI-colorazione negativa, o DAPI-positive caratteristiche (Figura 3E). L'oggetto fluorescente viene esaminato per le caratteristiche DIC tipici e atipici nello stesso modo come descritto per Cryptosporidium.Se caratteristiche atipiche non vengono osservate, l'oggetto viene registrata nel totale IFA e classificati come vuoto struttura di contenimento amorfa, o con uno o più tipi di strutture interne presenti (Figura 3F). Qualsiasi organismo che si osserva di avere caratteristiche atipiche non dovrebbe essere considerato come un (oo) cisti. Analisi al microscopio di campioni ambientali può essere difficile in quanto vi sono organismi che possono auto-fluorescenti o cross-reagiscono con il FITC-coniugato anti-Cryptosporidium e / o anticorpi anti-Giardia 1. Si raccomanda che un analista avere familiarità con i microbi acquatici e decine di revisione di slide per acquisire esperienza identificare Cryptosporidium e Giardia. Almeno tre (oo) cisti sul vetrino del controllo positivo colorazione dovrebbe essere caratterizzato prima di ogni sessione al microscopio. Campioni di controllo di qualità può essere arricchito con (oo) cisti per determinare il rec per centoOvery per ogni protozoo utilizzando il calcolo: (Oo) Percentuale di recupero cisti = ((Count Sample QC – Contare da campioni non diluiti) / Spike) x 100. Figura 1. Rappresentazione grafica del flusso tangenziale a fibre cave sistema di ultrafiltrazione. Il tubo di codifica a colori per facilitare sia l'assemblaggio del sistema. Figura 2. Immagine rappresentativa fluorescenza di Cryptosporidium e Giardia (oo) cisti. Oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia sono state colorate con marcato con FITC anti-Cryptosporidium / Giardia anticorpi. Frecce, cisti Giardia, punte di freccia, oocisti di Cryptosporidium. Un totale di quattro oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia sei sono stati trovati nel piano di messa a fuoco. I campioni osservabilied in un ingrandimento di 200X. . Figura 3 immagini rappresentative microscopiche di oocisti di Cryptosporidium e cisti Giaridia utilizzati per la caratterizzazione oocisti di Cryptosporidium (A – C). Brillante fluorescenza verde mela FITC di oggetti sferici da 4 a 6 micron di diametro con i bordi evidenziati brillantemente (A) contenenti fino a quattro distinti, sky-blue nuclei DAPI (B) e una a quattro sporozoiti (S) per oocisti (C). cisti di Giardia (D – F). Brillante verde mela FITC del round agli oggetti ovoidali 8 – 18 micron di lunghezza per 5 – 15 micron di larghezza con bordi luminosi evidenziati (D) contenenti fino a quattro sky-blue nuclei DAPI (E) e con uno o più distinguibile struttura interna tale come nuclei (N), corpo mediano (M) e assonemi o (A) (F). Frecce bianche, fluorescenza verde mela brillante colorazione oocisti di Cryptosporidium e Giardia cisti walls, punte di freccia bianche, nuclei DAPI positivi. I campioni osservati sotto ingrandimento 1000X.