Este protocolo descreve o uso de um tangencial de fibra oca de sistema de ultrafiltração de fluxo concentração da amostra e uma dissociação de calor como passos alternativos para a detecção de waterborne<em> Cryptosporidium</em> E<em> Giardia</em> Espécie, utilizando o método EPA 1623.
Espécies de Cryptosporidium e Giardia são duas das mais prevalentes protozoários que causam surtos de doenças diarreicas transmitidas pela água em todo o mundo. Para melhor caracterizar a prevalência desses patógenos, o método EPA 1623 foi desenvolvido e utilizado para monitorar os níveis destes organismos na água potável dos EUA fornece 12. O método tem três partes principais: a primeira é a concentração da amostra em que pelo menos 10 L de água da superfície em bruto é filtrado. Os organismos e detritos preso são então eluída a partir do filtro e centrifugado para concentrar ainda mais a amostra. A segunda parte do método utiliza um procedimento de separação imunomagnética onde a amostra de água concentrado é aplicado a esferas imunomagnéticas que se ligam especificamente para os oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia permitindo a remoção específica dos parasitas do detritos concentrada. Estes cistos (OO) são, então, separada das esferas magnéticas por uma dissociação de ácido procediDure. A parte final do método é a coloração de imunofluorescência e enumeração onde (oo) cistos são aplicados a um slide manchado, e enumerados por microscopia.
Método 1623 tem quatro sistemas de amostragem listadas concentração para capturar oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia na água: filtros Envirochek (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), filtros Envirochek HV (Pall Corporation), Filta-Max filtros (IDEXX, Westbrook, MA), ou centrifugação de fluxo contínuo (Haemonetics, Braintree, MA). No entanto, Cryptosporidium e Giardia recuperações (oo) cistos têm variado muito, dependendo da matriz de fontes de água e filtros usados 1,14. Um novo fluxo tangencial de fibra oca de ultrafiltração sistema (HFUF) foi recentemente mostrado ser mais eficaz e mais fiável à recuperação de oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia da água a partir de matrizes diferentes, além disso, é menos caro do que a opção cápsula outro filtroS e pode concentrar-se agentes patogénicos múltiplos simultaneamente 1-3,5-8,10,11. Além disso, estudos anteriores por Hill e colaboradores demonstraram que a HFUF significativamente melhorada recuperações dos oocistos de Cryptosporidium quando comparado directamente com os filtros Envirochek HV 4. Modificações adicionais aos métodos atuais também têm sido relatadas para melhorar o desempenho do método. Substituindo o procedimento de dissociação de ácido com o calor de dissociação foi mostrado ser mais eficaz na separação Cryptosporidium a partir das esferas magnéticas, em alguns 9,13 matrizes.
Este protocolo descreve um método modificado 1623 que utiliza o novo sistema de filtração HFUF com o passo de dissociação de calor. A utilização de HFUF com este método modificado é uma alternativa menos caro para actuais método EPA 1623 opções de filtração e proporciona uma maior flexibilidade, permitindo que a concentração de vários organismos.
Ultrafiltração de fluxo tangencial de fibra oca de é uma técnica alternativa e eficaz para a concentração inicial de oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia de água. De fibra oca de ultrafiltração é menos dispendioso do que os filtros tradicionais. Uma vez que tem a capacidade de concentrar oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia a partir de uma variedade de matrizes de água diferentes, é uma alternativa útil para as técnicas de filtração de corrente utilizados para o método EPA 1623. Tal como acontece com a maioria dos métodos de filtração outros, de fibra oca de ultrafiltração é propenso a incrustação com amostras extremamente turvos. Pressão de água de alta que resultaria da incrustação de filtro;, por conseguinte, é recomendado para monitorizar a pressão durante a execução de filtração. Além oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia, de fibra oca de ultrafiltração foi mostrado para ser capaz de se concentrar bactérias e vírus 1-3,5,8. De fibra oca de ultrafiltração outlined neste método pode ser utilizado para concentrar organismos múltiplos numa única amostra. É digno de nota que a obtenção de um volume final entre 200 e 250 ml é o passo crítico final no processo de concentração, de forma que os passos de centrifugação extra, que pode resultar em (oo) perda do cisto, são evitados (passo 2.2). No entanto, permitindo que o volume da garrafa para deixar cair demasiado baixo pode ter efeitos nefastos sobre as recuperações desde que não haverá volume de líquido suficiente para obrigar todos os oocistos ou cistos dentro da garrafa retentado. Portanto, recomenda-se a manter um volume final entre 200 e 250 ml.
O calor de dissociação é uma alternativa ao passo de dissociação de ácido no Método 1623. Esta etapa alternativa tem sido mostrado para melhorar a recuperação de oocistos de Cryptosporidium e reduzir a variação do método, quando isolado a partir de qualquer rio ou água reagente 9. Uma comparação lado-a-lado de ácido e os métodos de calor de dissociação demonstrado que o uso de calor para dissociaçãote os organismos a partir das esferas imunomagnéticas produzido mais elevadas recuperações médios para ambos Cryptosporidium e Giardia. Além disso, a precisão de recuperações de Cryptosporidium e Giardia foi melhor nas amostras processadas com calor dissociação em comparação com o ácido 9 dissociação.
A incorporação de HFUF como o passo de concentração permite mais flexibilidade, proporcionando a capacidade de concentrar vários organismos. Além disso, é uma alternativa menos dispendiosa aos actuais Método 1623 opções de filtragem.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Ann Grimm e Michael Zimmerman para revisão crítica deste manuscrito e Doug Hamilton para o seu suporte técnico.
Equipment/Reagent | Vendor | Catalog # |
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R |
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole Parmer | EW-06408-73 |
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-24 |
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-15 |
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-36 |
I/P Precision Brushless Drive | Cole Parmer | EW-77410-10 |
I/P Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-77601-10 |
Black HDPE Tee, 1/4″x 3/8″ x 3/8″ | US Plastics | 62064 |
Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole Parmer | EG-30613-12 |
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole Parmer | EW-06257-10 |
10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C |
Nalgene filling/venting cap for 1/4″ tubing, 53B | Cole Parmer | EW-06258-10 |
Pressure gauge | Cole Parmer | A-680-46-10 |
Straight coupling, NPT(F), 1/4″ | Cole Parmer | EW-06469-18 |
NPT branch tee, natural pp | Cole Parmer | A-30610-75 |
Pinch clamps, 1/2″ | Cole Parmer | EW-06833-00 |
Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 |
Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B |
Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q |
Keck ramp clamp, 14mm | Cole Parmer | EW-06835-10 |
Sodium polyphosphate | Sigma Aldrich | 305553 |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | 72050 |
Antifoam Y-30 emulsion | Sigma Aldrich | A5758 |
Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 |
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR | IR314-0025 |
Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 |
250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 |
Disposable funnel | Cole Parmer | U-6122-10 |
Wash bottle | Cole Parmer | U-06252-40 |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ARIES SX4750 |
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter | 349849 |
200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 |
VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 |
5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D |
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 |
50 ml conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 |
Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 |
Timer | VWR | 23609-202 |
Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D |
1 ml pipettes | VWR | 53283-700 |
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 |
1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P1000/DF1000ST |
100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P100/DF100ST |
9 inch Pasteur pipettes | VWR | 14672-412 |
Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D |
Vortex | VWR | 14216-188 |
Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 |
Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 |
Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 |
Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 |
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma | P4417 |
Single Spot slides | IDEXX | 30201 |
Cover glass | Corning | 287018 |
EasyStain direct kit | BTF | – |
10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P10 & DF10ST |
4′,6′-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 |
Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 |
Methanol | Fisher Scientific | L6815 |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 |
Incubator | Boekel Scientific | 133000 |
slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 |
Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon | MXA20234 |
Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon | MBA 77000 |
Plan APO 100X oil objective | Nikon | MRD01901 |
Plan Achro 20X | Nikon | MRL00202 |
FITC filter | Nikon | 96302 |
DAPI filter | Nikon | 96301 |
X-cite fluorescence illuminator | Nikon | 87540 |
Lens paper | Nikon | 76997 |
Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D |
Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 |
3 % hydrogen peroxide | VWR | BDH3540-2 |
Bleach | Fisher Scientific | 1952030 |
Wypall | Kimberly Clark | 34790 |