Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect<em> Cryptosporidium</em> Und<em> Giardia spp.</em

1. Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration Vorgehensweise Herstellung von Puffern und Lösungen: Elutionslösung (1 l): Um 1 L analysenreines Wasser hinzufügen, 0,1 g Natriumpolyphosphat, 0,1 ml Tween-80 und 0,01 ml Y-30 Entschäumer. Bereiten Filteranordnung (Abbildung 1) in einem biologischen Sicherheitsschrank: Legen Sie Masterflex I / P 73 Labor-Schlauch durch eine Masterflex I / P Easy-Load Pumpenkopf verbunden mit einer Masterflex I / P Präzisions Brushless-Antrieb. Sichern Sie den Schlauch mit einer 0-60 psi, Glycerin gefüllte Manometer mit NPT-Filiale T-Verbinder vor der Pumpe Kopf mit einer Schraubverbindung ausgestatteten, und zu einem HDPE-T-Stecker hinter dem Pumpenkopf. Montieren Sie die Flasche Retentat durch den Einbau eines Nalgene 53-B Befüllung / Entlüftung Verschluss mit Masterflex L / S 15 Labor-Schlauch und ein T-Stück und befestigen Sie sie in einen 1 l Nalgene schwere Polypropylen-Flasche. Fit Masterflex L / S 24 Schlauch wit einem Kneifklemme (Kneifklemme 2) und verbinden Sie es aus dem Retentat Flasche auf dem HDPE-T-Verbinder. Verbinden Sie die Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch aus dem Manometer an der Asahi Kasei Rexeed 25S High-Flux-Dialysatoren mit einer Schraubzwinge, und aus dem Dialysegerät zum Retentat Flasche. Verwenden Sie maßgeschneiderte DIN-Adapter entwickelt, um ¼ "ID Schlauch aufnehmen, um den Schlauch an die Hohlfaser-Ultrafiltration zu verbinden. Fit Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch mit einer Schlauchklemme (Schlauchklemme 1) und verbinden Sie es mit einer 10 ml Kunststoff-Pipette mit der Spitze und Baumwolle Stecker entfernt werden, um als Probenaufnahme Linie handeln, und befestigen Sie dann den Schlauch mit dem HDPE-T- Stecker. Befestigen Sie ein Ende der Masterflex L/S-36 Labor-Schlauch mit einer Rampe spannen und verbinden Sie den Schlauch an den Abwasser-Anschluss in der Nähe der Ausfahrt Ende des Filters befindet. Legen Sie das andere Ende in den Abfallbehälter. In 0,01% (w / v) Natriumpolyphosphat die 10 L Wasserprobe und Mischen für 3 min. Schließen einer Klammer 2und entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche. Alle anderen Klemmen offen sein sollte. Stellen Sie die Pumpe Richtung, um die Flüssigkeit aus dem T-Stück bewegen, um das Manometer (von rechts nach links folgende Abbildung 1). Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe auf 25% der maximalen Drehzahl und schalten Sie die Pumpe. Wenn das Retentat Flasche 2/3 voll, offene Schlauchklemme 2 ist, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe zum Retentat Flasche. Prüfen Sie alle Leitungen und Armaturen zu gewährleisten, keine Lecks vorhanden sind. Steigern Sie langsam die Drehzahl der Pumpe auf den gewünschten Filtrationsrate (ca. 1,5 L / min), Prüfung auf Dichtheit prüfen. Mit einem Messzylinder und einen Timer oder Durchflussmesser, überprüfen Sie das Filtrat des Wassers dem Austritt aus dem Abwasser Linie (blau L / S 36 Schlauch in Abbildung 1). Luftblasen können typischerweise am Ausgangsende des Filters macht es schwierig, einen stabilen Druck und Filtration zu erzielen bilden. Dies wird durch Einklemmen des Abflussleitung von Hand für einen Moment korrigiert. Diese Aktionwird in der Regel Koax die Luftblase zum Filtrat Hafen und über das Abwasser Linie zu verlassen. Wiederholen Sie nach Bedarf, wenn man bedenkt, dass Erbsengröße Luftblasen oft unvermeidlich sind. Überwachen Sie die Filtration. Messung und Aufzeichnung des Druckes und der Filtrationsrate nach Bedarf. Der Druck sollte nie mehr als 20 psi. Es wird empfohlen, dass die Filtrationsrate sollte nicht mehr als 2,0 l / min. Es ist wichtig, dass das Volumen des Wassers in der Flasche Retentat überwacht, um sicherzustellen, dass es nie entleert werden. Es ist normal, das Volumen zu erhöhen oder zu verringern leicht. Wenn die Wassermenge im Retentat Flasche fällt unter 1/3 voll ist, entfernen Sie dann die Entlüftungskappe und enge Kneifklemme 2 auf dem Retentat Flasche Linie. Bringen Sie die Lautstärke wieder auf etwa 2/3 voll, öffnen Sie die Klemme und schnell ersetzen Sie die Entlüftungskappe, wodurch eine gute Abdichtung. Wenn die Lautstärke im Retentat Flasche fällt schnell und kontinuierlich, dann sicher, das Retentat Flaschendeckel ist dicht und die Entlüftungskappe ist sicher an seinem Platz, und dass die tubing ist immer noch in Kontakt mit der Wasserprobe. Wenn diese Probleme nicht auftreten, dann ist es wahrscheinlich, dass die Dichtung im Retentat Flaschendeckel ist schlecht und sollte ausgetauscht werden. Wenn die Probe Behälter leer ist, unmittelbar in der Nähe einer Klammer ein, reduzieren Sie die Drehzahl der Pumpe bis 20% seiner maximalen, entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche und schließen Sie die Rampe Klemme. Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf ca. 200 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme Rampe. Nachdem das Volumen beträgt ca. 200 ml, ziehen Sie die Klammer für die Rampe Elutionsschritte (1,11-1,12). In 500 ml Elutionslösung auf die Probe und spülen das Innere des Behälters. Legen Sie die 10 ml-Pipette mit dem Probenaufnahme Linie in den Behälter, der die Elutionslösung enthält. Stellen Sie sicher, dass die Rampe Nadelklemme geschlossen ist. Offene Schlauchklemme 1 und 2 nahe Kneifklemme momentan für die Erarbeitung der Elutionslösung. Nachdem die 500 ml Elutionslösung erstellt wird, In der Nähe einer Klammer 1 und 2 offene Schlauchklemme. Lassen Sie die Elutionslösung für 5 Minuten mit einer Drehzahl von 20% seiner maximalen zirkulieren. Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf etwa 100 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme an der Rampe Abwasser Linie. Ziehen Sie die Rampe Klammer und lassen Sie die Probe für 1 Minute zirkulieren. Vermeiden Ziehen von Luft in der Rohrleitung, indem sie die Menge der Probe in dem Retentat Flasche ist hoch genug, um die L / S 15 Schlauch in die Flasche Retentat bestimmt. Umkehren der Richtung der Pumpe, die die Probe in das Retentat zwingt Flasche. Die Pumpe in umgekehrter für 20 Sekunden, was zu einer insgesamt ~ 225 ml Flasche im Retentat ausgeführt. Schalten Sie die Pumpe. Entfernen Sie die Masterflex I / P 73 Schläuche aus dem Pumpenkopf und ziehen Sie das Manometer. Trennen Sie die Masterflex L / S 24 Schlauch Verlassen des Hohlfaser-Ultrafiltration. Halten Sie den Schlauch über dem Retentat Flasche, um alle verbleibenden Probe in die KraftRetentat Flasche. Trennen Sie alle Schläuche von der Flasche, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe mit einem nicht-Entlüftungskappe. Fahren Sie mit dem IMS / IFA Prozedur mit der ~ 225 ml Retentat. 2. Immunomagnetische Trennverfahren Herstellung von Puffern und Lösungen: Lassen Sie die Puffer in den Dynabeads enthalten: Cryptosporidium / Giardia Combo Kit auf Raumtemperatur bringen. 1X SL-Puffer A: 1 ml 10X SL-Puffer A bis 9 ml gereinigtem Wasser. Übertragen der ~ 225 ml Flüssigkeit aus dem Retentat Flasche mit einer markierten konischen 250 ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Retentat Flasche zweimal mit 10 ml Reagenz Wasser, und fügen Sie die Spülungen an den konischen Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1500 xg für 15 min bei 4 ° C ohne Bremse. Vorsichtig Aspiration des Überstands aus der Luft-Wasser-Grenzfläche zu 5 ml oberhalb der verdichteten Pellets für jeden 0,5 ml Pellet-Volumen (dh Anspruch 1 Aspirat5 ml oberhalb einer Pellet-Volumen von 1,3 ml, und saugen bis 5 ml für eine Pellet von 0,5 ml oder weniger). Gründlich das Pellet in den Überstand durch Vortexen und / oder Mischen in der Pipette. Übertragen Sie jede 5 ml Volumen der Flüssigkeit auf die flachseitige Dynal L10 Röhrchen mit 1 ml jeder der SL-10X und 10X Puffer A SL-Puffer B. Spülen Sie den konischen Zentrifugenröhrchen zweimal mit 2,5 ml Reagenz Wasser und fügen Sie die zu spülen die L10 Rohr, wodurch das Gesamtvolumen der L10 Rohr 12 ml, einschließlich den Puffern. Geben Sie 100 ul jeder der gut gemischten resuspendierten anti-Cryptosporidium und Giardia Dynabeads anti-L10 an die Röhre. Drehen Sie das Rohr L10 bei 18 UpM für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator Mixer. Legen Sie die flache Seite der L10 Rohr gegen den MPC-6 Magneten und sanft die Hand Fels das Rohr Ende-zu-Ende, 180 ° für 2 Minuten. Halten Sie die L10 Rohr in der MPC-6-Magnet mit dem Magnet nach oben, dekantieren Sie den Überstand weg von der Raupe / (oo) Zyste Komplexe bound auf den Magneten. Entfernen Sie die L10 Rohr vom Magneten und 0,5 ml 1X SL-Puffer A auf das Rohr. Die Suspension unter Verwendung von zwei zusätzlichen Spülungen von 0,5 ml 1X SL-Puffer A in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im MPC-S mit dem Magneten in der vertikalen Position gehalten wird. Schütteln Sie die Röhre in den MPC-S Magnet 180 ° für 1 Minute. Mit dem Magneten an Ort und Stelle, Aspiration des Überstands mit einer Pasteurpipette nach unten gerichteten der Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml 1X PBS, um die Vorderseite des Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen Sie den Magneten und rocken das Rohr nur sanft, bis die Beads resuspendiert werden. Ersetzen Sie den Magneten in die senkrechte Position und schaukeln das Rohr um 180 ° für 1 Minute. Saugen Sie das PBS spülen, ohne das Pellet Perle, mit einer Pasteurpipette, um so viel Schmutz wie möglich zu entfernen. Entfernen Sie den Magneten und 50 l Reagens Wasser auf die Rückseite des Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Röhre bei voller Geschwindigkeit für 50 Sekunden,dann Inkubieren der Röhrchen bei 80 ° C für 10 Minuten gefolgt von 30 Sekunden Wirbels folgt. Ersetzen Magnet in den MPC-S in der angeschrägten Position, die Bindung der Kügelchen an dem Magneten und Verlassen der (oo) Zysten in der Flüssigkeit. Tragen Sie die (oo) Zyste Suspension auf einen SingleSpot gut gleiten. Wiederholen Schritt 2.10, Aufbringen der Flüssigkeit auf der gleichen Quelle, welche die erste Dissoziation. Objektträger auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 1 Stunde, um die Suspension auf den Objektträger gut trocknen lassen. 3. Färbung und Untersuchung Herstellung von Puffern und Lösungen: Arbeiten DAPI-Lösung: Fügen Sie 25 ul DAPI-Stammlösung (2 mg / ml in Methanol) zu 25 ml 1X PBS. Shop Lager und funktionierende Lösungen zwischen 1 ° C und 10 ° C im Dunkeln. Bewerben 50 ul Methanol zu der Folie gut und lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen. Dann werden 50 ul der Arbeiterklasse DAPI-Lösung auf den Objektträger gut und inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen Kimwipe, die DAPI aus dem Brunnen Docht. Bewerben 50 ul EasyStain. Bei 35 ° C für 30 Minuten. Wick den Fleck weg das auch mit einem Kimwipe, und dann langsam 300 pl kaltem EasyStain Befestigung Puffer, so dass sie gut über den Rand fließen. Inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen Kimwipe, um den Puffer aus dem Brunnen Docht und anwenden 10 ul EasyStain Eindeckmedium. Tragen Sie vorsichtig ein Deckgläschen werden, indem alle Blasen, die auftreten können. Dichten Sie das Deckglas mit klarem Nagellack. Scannen Sie die gesamte Folie mit dem FITC-Filter, bei 200facher Gesamtvergrößerung, für eiförmig oder kugelig Apfel-grün fluoreszierende Objekte, die ein Oozysten oder Zysten ähneln. Untersuchen Sie alle diese Objekte mit dem DAPI-Filter bei 1000X Gesamtvergrößerung und dann mit DIC, auch bei 1000X Gesamtvergrößerung. Notieren Sie die Größe mit einem kalibrierten Okularmikrometer und morphologischen Eigenschaften. Resultate zu dokumentieren. Hinweis: Weitere InformationenInformationen über die ursprüngliche Prozedur kann in der Dezember-2005-Version von EPA-Methode 1623 12 zu finden. Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration beschriebenen Verfahren wird anstelle Abschnitt 12.0 der EPA-Methode 1623 verwendet. Die Hitze Dissoziation ändert Abschnitt 13.3.3 der EPA-Methode 1623. Das Verfahren beschreibt auch eine zusätzliche PBS während der IMS-Prozess, der in der Dezember-2005-Version von Method 1623 nach Abschnitt 13.3.2.16 eingefügt werden können spülen. Die vollständige Liste der Verbrauchsmaterialien, Reagenzien und Geräte für die EPA-Methode 1623 auch diese Modifikationen verwendet wird in der Anlage aufgeführt. 4. Repräsentative Ergebnisse Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten durch die Prozesse der Filtration und Separation immunomagnetische zurückgewonnen werden durch mikroskopische Analyse nachgewiesen. Bei 200facher Gesamtvergrößerung, zeigt jeder Organismus eine typische Färbemuster, Größe und Form wie in Abbildung 2 gezeigt </strong> sollte weiter beobachtet werden mittels Ölimmersion bei 1000X Gesamtvergrößerung. Dies wird für die Messung und Identifizierung von entweder typisch oder atypisch bestimmenden Merkmale Features, die ausschließen, würde eine positive Identifizierung zu ermöglichen. Cryptosporidium ist ein kugelförmiges Objekt eiförmig bis 4 bis 6 &mgr; m im Durchmesser, die brillante apfelgrün FITC-Fluoreszenz mit hell hervorgehobenen Kanten (Abbildung 3A zeigt ). Mit DAPI UV, wird ein Oozysten weisen eine der folgenden Kategorien typisches Merkmal: hellblau interne Färbung mit einem grünen Rand und ohne deutliche Kerne (DAPI negativ), intensiv blaue Färbung interne oder bis zu vier verschiedene, himmelblauen Zellkerne (DAPI positiv – 3B). Atypische Features sind Abweichungen in Farbe, Struktur oder DAPI-Fluoreszenz (zB zu viele gefärbte Zellkerne, rot fluoreszierende internen Strukturen). Wenn das fluoreszierende Objekt Kriterien für typische FITC und DAPI-Färbung erfüllt hat, wird untersucht, mit Differential-Interferenz-conKontrast (DIC). Die Aufgabe wird für atypische äußeren oder inneren morphologischen Merkmalen wie Zellwand Ornamente oder ein oder zwei große Kerne Füllen der Zelle untersucht. Wenn atypische Strukturen nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere oder amorphe Struktur mit 1-4 Sporozoiten vorhanden (Abbildung 3C). Ebenso werden Giardia-ähnliche Objekte in Bezug auf FITC und DAPI-Färbung sowie DIC Eigenschaften, wie Axonemen, Median Körper und Kernen untersucht Giardia Zysten sind rund bis eiförmig brillante apfelgrün Objekte, 8 -. Von 18 &mgr; m lange 5 – 15 mu m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (3D). Mit UV-DAPI wird die Giardia Zyste zeigen DAPI-negative Färbung, oder DAPI-positiven Eigenschaften (3E). Das fluoreszierende Aufgabe wird durch DIC für typischen und atypischen Merkmalen in der gleichen Weise untersucht wie Cryptosporidium beschrieben.Wenn atypische Merkmale nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere haltige amorphe Struktur, oder mit einem oder mehreren Art der internen Strukturen vorhanden (3F). Jeder Organismus, der beobachtet, dass atypische Merkmale aufweisen wird, sollte nicht als ein (oo) Zyste gezählt werden. Die mikroskopische Analyse von Umweltproben kann eine Herausforderung sein, da es Organismen, die Auto-fluoreszieren oder kann mit dem FITC-konjugierten anti-Cryptosporidium und / oder anti-Giardia Antikörper ein kreuzreagieren. Es wird empfohlen, ein Analyst vertraut mit aquatischen Mikroben und Kritik Dutzende von Dias zu identifizieren Erfahrung Cryptosporidium und Giardia zu gewinnen. Mindestens drei (oo) Zysten an der positiven Färbung Kontrollen sollten vor jeder Sitzung am Mikroskop charakterisiert werden. Qualitätskontrolle Proben können mit (oo) Zysten versetzt werden, um die Prozent rec bestimmenOvery für jedes Protozoon mit der Berechnung: (Oo) Zyste prozentuale Ausbeute = ((QC Probe Graf – Graf von unversetzten Sample) / Spike) x 100. Abbildung 1. Grafische Darstellung der Tangentialströmung Hohlfaser-Ultrafiltration. Der Schlauch wird farbkodiert, um zu helfen ist die Montage des Systems. Abbildung 2. Vertreter Fluoreszenzbild Cryptosporidium und Giardia (oo) Zysten. Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden mit FITC-markiertem anti-Cryptosporidium / Giardia Antikörpern gefärbt. Arrows, Giardia Zysten, Pfeilspitzen, Cryptosporidium-Oozysten. Insgesamt vier Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden sechs in der Ebene der Fokus gefunden. Die Proben beobachtbareed unter 200-facher Vergrößerung. . Abbildung 3 Vertreter mikroskopische Aufnahmen von Cryptosporidium-Oozysten und Zysten Giaridia zur Charakterisierung herangezogen Cryptosporidium-Oozysten (A – C).. Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von kugelförmigen Objekten von 4 bis 6 &mgr; m im Durchmesser mit hell hervorgehobenen Kanten (A) mit bis zu vier verschiedene, himmelblauen DAPI Kerne (B) und 03.59 Sporozoiten (S) pro Oozysten (C). Giardia-Zysten (D – F). Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von rund bis eiförmig Objekte von 8 bis 18 mu m lang und 5 bis 15 &mgr; m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (D) mit bis zu vier himmelblauen DAPI Kernen (E) und mit einem oder mehreren erkennbaren inneren Struktur solcher als Kerne (N), mittleren Körper (M) und Axonemen oder (A) (F). Weiße Pfeile, brillante apfelgrün Fluoreszenzfärbung Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wBesserwisser, weiße Pfeilspitzen, DAPI positiven Kernen. Proben beobachtet unter 1000-facher Vergrößerung.