Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis<em> Cryptosporidium</em> En<em> Giardia spp.</em

1. Tangentiële Flow holle-vezel Ultrafiltratie Procedure Voorbereiding van de buffers en oplossingen: Elutie Oplossing (1 L): Om 1 liter reagens kwaliteit water toe te voegen 0,1 g natriumpolyfosfaat, 0,1 ml Tween-80 en 0,01 ml Y-30 antischuim. Bereid filter (figuur 1) in een biologisch veiligheidskabinet: Plaats Masterflex I / P 73 lab slang door een Masterflex I / P Easy-Load pompkop is aangesloten op een Masterflex I / P precisie borstelloze aandrijving. Zet de slang op een 0-60 psi, glycerine gevulde manometer voorzien van een NPT branch T-aansluiting stroomopwaarts van de pomp met een schroef klem en een HDPE T-connector stroomafwaarts van de pomp. Monteer de retentaat fles door het aanbrengen van een Nalgene 53-B vulling / ontluchting dop met Masterflex L / S 15 lab slang en een T-connector en zet deze vast aan een 1 L Nalgene zware polypropyleen fles. Fit Masterflex L / S 24 slangen wet een snuifje klem (knijpklem 2) en sluit hem uit het retentaat fles om de HDPE T-connector. Sluit de Masterflex L / S 24 lab slang van de manometer aan de Asahi Kasei Rexeed 25S high-flux kunstnier met een schroef klem, en van de kunstnier op de retentaat fles. Gebruik maat DIN adapters ter ¼ "ID buis te passen aan de slang verbinding met de holle vezel ultrafilter. Fit Masterflex L / S 24 lab buis met een snufje klem (knijpklem 1) en sluit hem aan op een 10 ml plastic pipet met de punt en katoen plug verwijderd op te treden als het monster opname lijn en dan de slang hechten aan de HDPE T- connector. Bevestig een uiteinde van Masterflex L/S-36 lab buis met een helling klem en de slang aansluiten op de effluent-poort die zich bij de uitgang einde van het filter. Plaats het andere uiteinde in de afvalcontainer. Voeg 0,01% (w / v) natriumpolyfosfaat de 10 l water monster en meng gedurende 3 minuten. Sluit knijpklem 2en verwijder de ontluchting dop van de retentaat fles. Alle andere klemmen moeten open. Stel de pomprichting de vloeistof verplaatsen van de T-connector de manometer (rechts naar links volgende figuur 1). Pas de snelheid van de pomp tot 25% van de maximale snelheid en zet de pomp. Wanneer de retentaat fles is 2/3 vol, open knijpklem 2 en snel de ontluchting dop te vervangen door het retentaat fles. Controleer of alle van de lijnen en fittingen om ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn. Verhoog langzaam het toerental van de pomp om de gewenste filtratie snelheid (ongeveer 1,5 L / min), het controleren op lekken. Met behulp van een maatcilinder en een timer of een debietmeter, controleer dan het filtraat van het water verlaten van het effluent lijn (blauw L / S 36 slangen in Figuur 1). Luchtbellen typisch gevormd aan het uitgangseinde van de filter waardoor het moeilijk om een ​​stabiel druk en filtratie bereiken. Dit wordt gecorrigeerd door te knijpen het effluent lijn met de hand voor een moment. Deze actiezal de luchtbel in het algemeen coax aan het filtraat haven en om af te sluiten via de afvoerleiding. Herhaal indien nodig, in gedachten houden dat erwt grootte luchtbellen vaak onvermijdelijk zijn. Controleer de filtratie proces. Meet en opnemen van de druk en de filtratiesnelheid nodig. De druk mag nooit hoger zijn dan 20 psi. Het wordt aanbevolen om de filtratiesnelheid niet moet 2,0 L / min overschrijden. Het is belangrijk dat de hoeveelheid water in het retentaat fles worden gewaakt dat het niet leeg. Het is normaal dat het volume te verhogen of te verlagen iets. Als het water volume in het retentaat fles lager is dan 1/3 vol, verwijder dan de ontluchting dop en dicht knijpen 2 klemmen op de retentaat bottellijn. Breng water aan tot ongeveer 2/3 vol, opent u de klem en snel de plaats van de ontluchting dop, zorgen voor een goede afdichting. Als het volume in het retentaat fles valt snel en continu, dan zorgen voor de retentaat fles deksel vast zit en de ontluchting dop stevig op zijn plaats, en dat de Tubing nog in contact met het monster. Als deze problemen niet worden voorkomen, dan is het waarschijnlijk dat de afdichting in het retentaat fles deksel slecht is en moet worden vervangen. Wanneer het monster container leeg is, onmiddellijk dicht knijpen klem 1, het toerental van de pomp te verlagen tot 20% van zijn maximum, verwijder de ontluchting dop van de fles retentaat en sluit de oprit klem. Pas het volume van het monster in het retentaat fles tot ongeveer 200 ml door het aandraaien of losdraaien van de ramp klem. Nadat het volume is ongeveer 200 ml, draai de oprit klem voor de elutie stappen (1.11-1,12). 500 ml elutie-oplossing aan de monsterhouder en spoel de binnenkant van de container. Plaats de pipet van 10 ml is aangesloten op het monster opname lijn in de container die de elutie oplossing bevat. Zorg ervoor dat de helling klem gesloten is. Open snufje klem 1 en dicht knijpen tijdelijk vast te klemmen 2 tot en met het opstellen van de elutie-oplossing. Na 500 ml elutie-oplossing wordt opgesteld, Dicht knijpen klem 1 en open knijpklem 2. Laat de elutie-oplossing circuleren 5 minuten met een toerental van 20% van zijn maximum. Pas het volume van het monster in het retentaat fles tot ongeveer 100 ml door het aandraaien of losdraaien van de ramp klem op de afvoerleiding. Draai de ramp klem en laat het monster te laten circuleren gedurende 1 minuut. Trek niet lucht in de slang door te zorgen volume van het monster in het retentaat fles hoog genoeg is om de L / S 15 buis die in de retentaat fles dekken. Draai de richting van de pomp die het monster dwingt de retentaat fles. Laat de pomp in omgekeerde uitgevoerd gedurende 20 seconden tot een totaal van ~ 225 ml in het retentaat fles. Zet de pomp. Verwijder de Masterflex I / P 73 slang van de pomp uit en koppel de drukmeter. Maak de Masterflex L / S 24 buizen het verlaten van de holle-vezel ultrafilter. Houd de buis boven de retentaat fles om alle resterende monster te ver in deretentaat fles. Ontkoppel alle slangen uit de fles en plaats de de kap met een niet-ontluchting dop. Ga verder naar de IMS / IFA-procedure met de ~ 225 ml retentaat. 2. Immunomagnetische Scheiding Procedure Voorbereiding van de buffers en oplossingen: Laat de buffers in de Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit op kamertemperatuur komen. 1X SL-buffer A: Voeg 1 ml 10x SL-buffer A tot en met 9 ml reagens kwaliteit water. Breng de ~ 225 ml vloeistof uit het retentaat fles een gelabeld 250 ml konische centrifugebuis. Twee keer Spoel de retentaat flesje met 10 ml reagens water, en voeg de spoelingen de conische centrifugebuis. Centrifugeer de suspensie 1500 g gedurende 15 min bij 4 ° C zonder rem. Zorgvuldig aspireren het supernatans van de lucht-water grensvlak aan 5 ml boven de pellet verpakt voor elke 0,5 ml pellet volume (dat wil zeggen aspiratie tot en met 15 ml boven een pellet volume van 1,3 ml, en zuig 5 ml voor een pellet van 0,5 ml). Grondig resuspendeer de pellet in de supernatant door vortexen en / of pipet mengen. Breng elke 5 ml van de vloeistof de vlakke zijden Dynal L10 buis 1 ml elk 10X SL-buffer A en 10X SL-buffer B. spoelen conische centrifugebuis tweemaal met 2,5 ml reagenswater en toevoegen sop de L10 buis, waardoor het totale volume van de L10 buis 12 ml, waaronder de buffers. Voeg 100 ul elk van de goed gemengde geresuspendeerde anti-Cryptosporidium en anti-Giardia Dynabeads aan de L10 buis. Draai de L10 buis 18 rpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een rotator mixer. Plaats de platte kant van de L10 buis tegen de MPC-6 magneet en zachtjes de hand rots de buis end-to-end, 180 ° gedurende 2 minuten. Houd de L10 buis in de MPC-6 magneet met de magneet kant naar boven, weg decanteer de bovenstaande uit de kraal / (oo) cyste complexen bound de magneet. Verwijder de L10 buis van de magneet en voeg 0,5 ml 1X SL-buffer A aan de buis. De suspensie met twee extra spoelingen van 0,5 ml 1X A SL-buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuisje gehouden in MPC-S van de magneet in de verticale stand. Schud de buis in de MPC-S magneet 180 ° gedurende 1 minuut. Met de magneet in plaats zuig de supernatant met een Pasteur pipet naar de bodem van de microcentrifugebuisje. Voeg 1 ml PBS 1X de voorzijde van de microcentrifugebuisje Verwijder de magneet en schud de buis slechts tot korrels worden geresuspendeerd. Plaats de magneet in de verticale positie en voorzichtig de buis 180 ° schommelen gedurende 1 minuut. Zuig het PBS, spoel zonder de kraal pellet met een Pasteur pipet te verwijderen vuil zoveel mogelijk. Verwijder de magneet en voeg 50 ul reagenswater de achterzijde van de microcentrifugebuisje. Vortex de buis op volle snelheid voor 50 seconden,vervolgens incuberen van de buis 80 ° C gedurende 10 minuten gevolgd door 30 seconden vortex. Plaats de magneet in de MPC-S in de schuine positie, het binden van de kralen aan de magneet en het verlaten van de (oo) cysten in de vloeistof. Breng de (oo) cyste suspensie naar een SingleSpot goed glijbaan. Herhaal stap 2,10, waarbij de vloeistof dezelfde goed met de eerste dissociatie. Plaats dia op 37 ° C warmer dia gedurende 1 uur aan de suspensie drogen aan de slede zijn. 3. Kleuring en Onderzoek Voorbereiding van de buffers en oplossingen: Werken DAPI oplossing toevoegen van 25 pi van DAPI stock oplossing (2 mg / ml in methanol) 25 ml 1X PBS. Store voorraad en werkende oplossingen tussen 1 ° C en 10 ° C in het donker. Breng 50 ul van methanol aan de slede goed en laat drogen bij kamertemperatuur. Pipetteer 50 ul van de werkende DAPI oplossing van het dia goed en incuberen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een Kimwiie aan de DAPI kous uit de put. Breng 50 ul van EasyStain. Incubeer bij 35 ° C gedurende 30 minuten. Wick de vlek uit de goed met een Kimwipe, en dan voeg langzaam 300 ul van koude EasyStain vaststelling van buffer, te laten stromen over het wel en rand. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een Kimwipe om de buffer kous uit de put en 10 ul van EasyStain Mounting Medium toe te passen. Breng zorgvuldig een dekglas, het verwijderen van luchtbellen die zich voordoen. Sluit het deksel slip met duidelijke nagellak. Scan de volledige dia het gebruik van de FITC-filter, op 200X totale vergroting, voor de eivormige of bolvormige appelgroen fluorescerende voorwerpen die lijken op een oocysten of cyste. Controleer al deze objecten met DAPI filter 1000X totale vergroting en vervolgens met DIC, ook op 1000X totale vergroting. Noteer de afmetingen met behulp van een geijkte oculair micrometer en morfologische kenmerken. Document resultaten. Let op: Extra informatieinformatie over de oorspronkelijke procedure is te vinden in de december 2005 versie van de EPA-methode 1623 12. De tangentiële stroming holle vezels beschreven ultrafiltratie procedure wordt gebruikt in plaats van artikel 12.0 van de EPA-methode 1623. De warmte dissociatie wijzigt Sectie 13.3.3 van de EPA-methode 1623. De procedure beschrijft ook een extra PBS spoelen tijdens de IMS-proces, dat kan in de in december 2005 versie van de Methode 1623 worden toegevoegd na punt 13.3.2.16. De volledige lijst van verbruiksartikelen, reagentia en apparatuur die wordt gebruikt voor de EPA-methode 1623 met inbegrip van deze wijzigingen is opgenomen in de lijst met apparaten. 4. Representatieve resultaten Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten hersteld door de processen van filtratie en separatie immunomagnetische worden gedetecteerd door microscopische analyse. Bij 200X totale vergroting elk organisme vertonen typisch kleuringspatroon, grootte en vorm als weergegeven in figuur 2 </strong> moet verder worden waargenomen met behulp van olie-immersie bij 1000X totale vergroting. Dit zal voor het meten en de identificatie van een van beide typische bepalende kenmerken of atypische kenmerken die zou uitsluiten positieve identificatie. Cryptosporidium is een eivormige tot bolvormig voorwerp 4 tot 6 micrometer in diameter die briljante appelgroen FITC fluorescentie vertoont met helder gemarkeerde randen (figuur 3A ). Met DAPI UV, zal een oocysten vertonen een van de volgende typisch kenmerk categorieën: lichtblauw interne kleuring met een groene rand en geen afzonderlijke kernen (DAPI negatief), intens blauw interne vlekken, of maximaal vier verschillende, hemelsblauwe kernen (DAPI positieve – Figuur 3B). Atypische kenmerken zijn afwijkingen in kleur, structuur of DAPI fluorescentie (bijvoorbeeld te veel lood kernen, rode fluorescerende interne structuren). Als het fluorescerende voorwerp heeft voldaan aan de criteria voor typische FITC en DAPI kleuring, wordt het onderzocht met behulp van differentieel interferentie concontrast (DIC). Het voorwerp wordt onderzocht atypische externe of interne morfologische kenmerken zoals celwand versiering of een of twee grote kernen vullen cel. Als atypische structuren wordt waargenomen, wordt het object opgenomen in de totale telling IFA and gecategoriseerd als een lege amorfe structuur of met een tot vier sporozoieten onderhavige (Figuur 3C). Evenzo worden Giardia-achtige objecten onderzocht op FITC en DAPI kleuring en DIC kenmerken, zoals axonemes, mediaan lichamen en kernen Giardia cysten zijn rond tot eivormig briljante appelgroen objecten, 8 – 18. Micrometer lang en 5 – 15 micrometer breed met helder gemarkeerde randen (figuur 3D). Met DAPI UV, zal de Giardia cyste vertonen DAPI-negatieve kleuring of DAPI-positieve kenmerken (figuur 3E). De fluorescerende voorwerp wordt behandeld door DIC voor typische en atypische kenmerken op dezelfde wijze als beschreven voor Cryptosporidium.Als atypische kenmerken wordt waargenomen, wordt het object opgenomen in de totale telling IFA and gecategoriseerd als lege bevattende amorfe structuur, of met een of meer soorten interne structuren aanwezig (Figuur 3F). Elk organisme dat wordt waargenomen dat atypische kenmerken hebben, moeten niet worden beschouwd als een (oo) cyste. Microscopische analyse van milieu-monsters kan een uitdaging als er organismen die kunnen auto-fluoresceren of cross-reageren met de FITC-geconjugeerd anti-Cryptosporidium en / of anti-Giardia antilichamen 1. Het wordt aanbevolen dat een analist bekend te zijn met het water levende micro-organismen en herziening tientallen dia's om ervaring op het identificeren van Cryptosporidium en Giardia te krijgen. Ten minste drie (oo) cysten op de positieve kleuring controle dia moet voorafgaand aan elke sessie op de microscoop worden gekarakteriseerd. Kwaliteitscontrole monsters kunnen worden verrijkt met (oo) cysten om het percentage te bepalen recOvery elke protozoïsche met de berekening: (Oo) cyste Procent Recovery = ((QC Sample Count – Graaf van Unspiked Sample) / Spike) x 100. Figuur 1. Grafische voorstelling van de tangentiële stroming holle-fiber ultrafiltratie systeem. De slang heeft een kleurcode om te helpen is de montage van het systeem. Figuur 2. Vertegenwoordiger fluorescentie beeld van Cryptosporidium en Giardia (oo) cysten. Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten werden gekleurd met FITC gelabeld anti-Cryptosporidium / Giardia antilichamen. Pijlen, Giardia cysten, pijlpunten, Cryptosporidium oöcysten. Een totaal van vier Cryptosporidium oöcysten en zes Giardia cysten werden gevonden in het vlak van focus. Monsters waarneembareed onder 200X vergroting. . Figuur 3 Vertegenwoordiger microscopische beelden van Cryptosporidium oöcysten en Giaridia cysten worden gebruikt voor de karakterisering Cryptosporidium oöcysten (A – C).. Brilliant appelgroen FITC fluorescentie van bolvormige objecten 4 tot 6 micrometer in diameter met helder gemarkeerde randen (A) met maximaal vier verschillende, hemelsblauwe DAPI kernen (B) en een tot vier sporozoieten (S) per oocysten (C). Giardia cysten (D – F). Brilliant appel-groene fluorescentie FITC ronde tot ovaal voorwerpen 8-18 micrometer lang 5-15 pm brede met helder gemarkeerde randen (D) bestaat uit vier hemelsblauwe DAPI kernen (E) en een of meer waarneembaar inwendige structuur, als kernen (N), gemiddelde lichaam (M) en of axonemes (A) (F). Witte pijlen, briljante appel groene fluorescentie vlekken Cryptosporidium oöcysten en Giardia cysten wAlls, witte pijlpunten, DAPI positieve kernen. Monsters waargenomen onder 1000X vergroting.