Waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 EPA 방법 1,623<em> Cryptosporidium</em>과<em> Giardia SPP.</em

1. 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 절차 버퍼 및 솔루션의 준비 : 용출 솔루션 (1 패) : 시약 등급 물 1 L은 0.1 g 나트륨 polyphosphate, 0.1 ML 십대 초반-80 및 0.01 ML Y-30 antifoam을 추가하려면. 생물 학적 안전 캐비닛에 필터 어셈블리 (그림 1) 준비 : Masterflex I / P 정밀 brushless 드라이브에 연결된 Masterflex I / P 쉬운로드 펌프 헤드를 통해 Masterflex I / P 73 실험실 튜브를 삽입합니다. 나사 클램프와 펌프 헤드의 상류 NPT 지점 T-커넥터가 장착되어 0-60 PSI, 글리세린 가득한 압력 게이지에 튜브를 확보하고, 펌프 헤드의 HDPE T-커넥터 하류에. Nalgene Masterflex L / S 15 실험실 튜브와 53-B 충전 / 방출 모자와 T-커넥터를 맞추려고하고 1 패 Nalgene 무거운 듀티 폴리 프로필렌 병에 확보하여 retentate 병을 조립. Masterflex L / S 24 튜빙 W를 맞추기ith 핀치 클램프 (핀치 클램프 2)와 HDPE T-커넥터에 retentate 병에서 연결합니다. 압력 게이지에서 아사히 Kasei에 Masterflex L / S 24 실험실 튜브를 연결은 나사 클램프와 초 하이 플럭스 dialyzer을 Rexeed하고 dialyzer에서 retentate 병. 중공 섬유 ultrafilter에 튜브를 연결 ¼ "ID 튜빙을 수용하도록 설계된 맞춤 DIN 어댑터를 사용하십시오. 핀치 클램프 (핀치 클램프 1) Masterflex L / S 24 실험실 튜브를 장착하고 샘플 이해 라인 역할을 제거 팁 및 목화 플러그와 함께 10 ML 플라스틱 피펫에 연결하고 HDPE에 튜브를 장착 T- 커넥터. 램프는 필터의 출구 끝 부근 유출물 포트에 튜브 클램프 접속과 Masterflex L/S-36 실험실 튜브의 한쪽 끝을 어울린다. 폐기물 컨테이너의 다른 쪽 끝을 놓으십시오. 0.01 % (W / V) 10 L의 물을 샘플로 나트륨 polyphosphate 및 3 분 혼합을 추가합니다. 핀치 클램프 2 닫기그리고 retentate 병의 배출구 뚜껑을 제거합니다. 다른 모든 클램프가 열려 있어야합니다. 압력 게이지 (왼쪽 아래 그림 1 오른쪽)에 T-커넥터에서 유체를 이동하기 위해 펌프의 방향을 설정합니다. 최대 속도의 25 %로 펌프 속도를 조절하고 펌프를 켜십시오. retentate 병이 3분의 2 전체, 오픈 핀치 클램프 2 빠르게 retentate 병에 환기구 뚜껑을 교체합니다. 라인과 전혀 누수가없는 있도록 부속품을 모두 확인합니다. 천천히 누수를 확인하고, 원하는 여과 속도 (약 1.5 L / 분)로 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 졸업 실린더와 타이머 또는 플로우 미터를 사용하여 방류수 라인 (그림 1의 파란색 L / S 36 관)에서 종료 물을 여과물 속도를 확인합니다. 기포가 일반적으로 어렵게 안정적인 압력과 여과 속도를 달성하는 필터의 출구 끝에 형성할 수 있습니다. 이것은 잠시 손으로 유출물 라인을 곤란에 의해 수정되었습니다. 이 작업은일반적으로 여과물 포트에 공기 방울이 동축 케이블되며 유출물 라인을 통해 종료합니다. 완두콩 크기의 공기 방울은 종종 불가 피한 것을 염두에두고 필요에 따라 반복합니다. 여과 과정을 모니터링합니다. 필요에 따라 압력과 여과 속도를 측정하고 기록합니다. 압력이 20 Psi를 초과하지 않습니다. 이것은 여과 속도가 2.0 L / 분을 초과하지 말아야하는 것이 좋습니다. 그것은 retentate 병의 물을 볼륨은 강물을 쏟아 내죠 결코 않도록 감시하는 것이 중요합니다. 그것은 약간 높이거나 줄일 수있는 볼륨 정상입니다. retentate 병의 저수량은 아래 3분의 1 전체 떨어지는 경우 배출구 뚜껑을 제거하고 가까운 핀치는 retentate 병 라인에서 2 클램프. 대한 삼분의이 전체로 볼륨을 지참, 클램프를 열고 신속하게 단단히 밀봉을 보장, 환기구 뚜껑을 교체하십시오. retentate 병의 볼륨이 신속하고 지속적으로 떨어지는 경우 retentate 병 뚜껑을 꽉이며 배출구 캡이 제자리에 안전을 보장하고 있다고 tubiNG는 물 시료와 접촉 여전히입니다. 이러한 문제가 발생하지 않는 경우, 그때 그것은 retentate 병 뚜껑의 봉인이 불량이므로 교체해야 가능성이 높습니다. 샘플 컨테이너가 비어있는 경우, 즉시 가까운 핀치 클램프 1, 최대 20 %까지 펌프 속도를 줄이고, retentate 병에서 배출구 뚜껑을 제거하고 램프 클램프를 닫습니다. 램프 클램프를 강화하거나 풀어하여 약 200 ML에 retentate 병에 시료의 볼륨을 조정합니다. 볼륨이 약 200 ML되면 용출 단계 (1.11-1.12)에 대한 경사로 클램프를 조입니다. 샘플 용기에 용출 용액 500 ML을 추가하고 컨테이너의 내부를 씻어. 용출 용액이 들어있는 용기에 시료 이해 라인에 연결된 10 ML의 피펫를 놓습니다. 진입로 클램프가 닫혀 있는지 확인합니다. 오픈 핀치 1 클램프와 가까운 핀치는 용출 솔루션을 구축하기 위해 일시​​적으로 2 클램프. 용출 용액의 500 ML이 수립되면가까이 클램프 1과 오픈 핀치 클램프 2 꼬집어. 용출 솔루션은 최대 20 %의 펌프 속도를 5 분 동안 순환하도록 허용합니다. 유출물 줄에 램프 클램프를 강화하거나 풀어하여 약 100 ML에 retentate 병에 시료의 볼륨을 조정합니다. 램프 클램프를 조여하고 예제 1 분 순환 수 있습니다. retentate 병에 시료의 볼륨을 확보하여 튜브에 공기를 당기는 것은 피한다 retentate 병을 입력 L / S 15 튜빙을 감추기에 충분 할만큼 높습니다. retentate 병에 시료를 강제 펌프의 방향을 역방향. 펌프 retentate 병에 ~ 225 ML의 총 발생 20 초 동안 반대로 실행하도록 허용합니다. 펌프의 전원을 끕니다. 펌프 헤드에서 Masterflex I / P 73 튜브를 제거하고 압력 게이지를 분리합니다. 중공 섬유 ultrafilter을 종료 Masterflex L / S 24 튜브 연결을 끊습니다. 로 모든 나머지 샘플을 강제로 retentate 병 위에 튜브를 잡아병을 retentate. 병에서 모든 튜브를 분리하고 비 방출 캡으로 방출 뚜껑을 교체하십시오. ~ 225 ML의 retentate으로 IMS / IFA 절차로 진행합니다. 2. Immunomagnetic 분리 절차 버퍼 및 솔루션의 준비 : Cryptosporidium / Giardia 콤보 키트는 실내 온도에 도달 : Dynabeads에 포함된 버퍼를 허용합니다. 1X SL-버퍼 : 10X SL-버퍼 9 ML 시약 등급 물 1 ML을 추가합니다. 라벨 250 ML 원추형 원심 관에 retentate 병에서 액체 ~ 225 ML을 전송합니다. 시약 물 10 ML로 두 번 retentate 병을 씻어하고, 원추형 원심 튜브에 물에 빨고을 추가합니다. 4에 15 분 °없이 브레이크와 C에 대해 1,500 XG에 현탁액을 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛 볼륨의 모든 0.5 ML (즉, 기음 1을위한 공기 물 인터페이스에서 포장 펠렛 위의 5 ML에 뜨는을 기음5 1.3 ML의 펠릿 볼륨 위의 ML, 그리고 대기음 0.5 ML 이하)의 펠렛 5 ML합니다. 철저하게 vortexing 및 / 또는 피펫 혼합하여 뜨는로 펠렛을 resuspend. 한 ML을 포함하는 평면 양면 Dynal 10 파운드 라니 튜브에 액체 각 1 부​​ 5 ML 볼륨을 전송하고 SL-버퍼 B. 10X는 시약 물 2.5 ML로 두 번 원추형 원심 튜브를 씻어과에 린스를 추가 SL-버퍼 10X 각 버퍼를 포함하여 10 파운드 라니 튜브 ~ 12 ML의 전체 볼륨을 데려오 10 파운드 라니 튜브. 10 파운드 라니 튜브에 100 μl 잘 혼합 resuspended 안티 Cryptosporidium 및 안티 Giardia Dynabeads를 각각 추가합니다. 회전 믹서에 실온에서 1 시간 18 rpm으로 10 파운드 라니 튜브를 회전합니다. MPC-6 자석 부드럽게 손으로 바위 2 분을 튜브 엔드 – 투 – 엔드, 180 ° 반대 10 파운드 라니 튜브의 평평한 면을 넣습니다. 자석 측면과 MPC-6 자석에 10 파운드 라니 튜브를 유지할 수있다는 것은 최대, 비드 / (OO) 낭종 단지 보우 멀리 뜨는을 가만히 따르다자석에 ND. 자석에서 10 파운드 라니 튜브를 제거하고 튜브에 1X SL-버퍼 0.5 ML을 추가합니다. 수직 위치에있는 자석으로 MPC-S에서 열리는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로를 SL은 버퍼 1X 0.5 ML의 두 개의 추가 물에 빨고을 사용하여 현탁액을 전송합니다. 부드럽게 1 분 MPC-S 자석 180 °에서 튜브를 흔들. 대신에 자석으로 microcentrifuge 튜브의 하단으로 이동 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 기음. microcentrifuge 튜브의 전면 측면에 1X PBS 1 ML 추가 자석을 제거하고 구슬이 resuspended 때까지 그냥 부드럽게 튜브를 흔들. 수직 위치에 자석을 교체하고 부드럽게 1 분 관 180 °를 흔들. PBS는 가능한 한 많은 파편으로 제거하는 파스퇴르 피펫을 사용하여 비드 펠렛을 방해하지 않고, 린스 기음. 자석을 제거하고 microcentrifuge 튜브의 뒷면에 시약 물을 50 μl를 추가합니다. 와동 50 초만 전속력으로 튜브,다음 삼십초 와동이어서 10 분 동안 80 ° C에서 튜브를 품어. 자석에 비즈를 묶는 방식과 액체에 (OO) cysts두고, 한쪽으로 치우 쳤던 위치에서 MPC-S에 자석을 교체하십시오. SingleSpot 아니라 슬라이드에 (OO) 낭종 서스펜션을 적용합니다. 최초의 분리를 포함하는 동일한 잘으로 액체를 적용, 단계 2.10를 반복합니다. 37 ° C 슬라이드도 슬라이드에 현탁액을 건조하여 1 시간 정도 따뜻한 장소에 슬라이드. 3. 염색법 및 심사 버퍼 및 솔루션의 준비 : DAPI 솔루션을 일하는 것은 : 1X PBS의 25 ML에 DAPI 증권 솔루션 (메탄올 2 밀리그램 / ML) 25 μl를 추가합니다. 매장 재고와 1 ° C와 어둠 속에서 10 ° C 사이에서 작동 솔루션. 물론 슬라이드에 메탄올 50 μl를 적용하고 실온에서 건조하실 수 있습니다. 물론 슬라이드로 작동 DAPI 용액 50 μl을 넣고 실온에서 2 분 동안 품어. Kimwi 사용PE는 우물에서 DAPI를 심합니다. EasyStain 50 μl을 적용합니다. 30 분간 35 ° C에서 품어. Kimwipe으로 잘를 착색하고 천천히 그것이 잘 끄트머리로 흐를 수 있도록 추운 EasyStain 고정 버퍼 300 μl를 추가 위크. 실온에서 2 분 동안 품어. 우물에서 버퍼를 등심과 EasyStain 장착 매체의 10 μl을 적용하는 Kimwipe을 사용합니다. 조심스럽게 발생하는 기포를 제거, 커버 전표를 적용합니다. 투명 매니큐어로 커버 슬립을 봉쇄해. oocyst이나 낭종 유사 난형 또는 원형 사과 녹색 형광 개체, 200X 총 배율에서 FITC 필터를 사용하여 전체 슬라이드를 검사합니다. 또한 1000X 총 배율에서, 1000X 총 배율에서 DAPI 필터와 함께 다음 DIC있는 이러한 모든 개체를 검사합니다. 보정 안구 마이크로 미터 및 형태학의 특성을 사용하여 크기를 기록합니다. 문서 결과입니다. 참고 : 추가 infor원래 프로 시저에 대한 mation은 EPA 방법 1623 12 2005년 12월 버전에서 찾을 수 있습니다. 설명 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 절차는 EPA 방법 1623의 섹션 12.0 대신 사용됩니다. 열 분해는 EPA 방법 1623의 섹션 13.3.3을 수정합니다. 절차는 또한 추가적인 PBS 섹션 13.3.2.16 후에 방법 1623의 2005년 12월 버전에 삽입될 수 IMS 과정 린스 설명합니다. 이러한 수정 사항을 포함하여 EPA 방법 1623에 사용되는 소모품, 시약 및 장비의 전체​​ 목록은 장비 목록에 나열됩니다. 4. 대표 결과 여과 및 immunomagnetic 분리의 과정을 통해 복구된 Cryptosporidium의 oocysts과 Giardia의 cysts는 현미경 분석에 의해 감지됩니다. 그림 2와 같이 200X 전체 배율에서, 각 유기체는 일반 염색법 패턴, 크기 및 모양을 전시 </stronG>는 더욱 1000X 전체 배율에서 기름 침지를 사용하여 관찰해야한다. 이것은. 일반적인 정의 기능이나 긍정적인 신분을 배제 것이 비정형 특징 중의 측정 및 식별을 위해 수 Cryptosporidium은 구면 개체 난형이다 밝게 강조 모서리 (그림 3A와 함께 빛나는 사과 녹색의 FITC의 형광을 전시 직경 4-6 μm의 ). 녹색 테두리없이 뚜렷한 핵 (DAPI 제외), 강렬한 파란색 내부 염색법, 또는 최대 4 개의 별개의, 스카이 블루 핵 (DAPI와 하늘색 내부 염색법 : DAPI 자외선으로 oocyst는 다음과 같은 일반적인 기능 범주 중 하나를 전시합니다 긍정 – 그림 3B). 비정형 특징은 색깔, 구조, 또는 DAPI 형광 (예를 들어, 너무 많은 스테인드 핵, 붉은 색은 내부 구조를 fluorescing)의 편차를 포함합니다. 형광 객체가 일반적인 FITC와 DAPI 염색법에 대한 기준을 충족하고있다면, 그것은 차동 간섭 죄수를 사용하여 검사하고 있습니다trast (DIC). 개체는 같은 세포 벽 장식, 또는 셀을 채울 하나 또는 두 개의 커다란 핵 같은 비정형 외부 또는 내부 형태학의 특성을 면밀히 검토합니다. 비정형 구조가 관찰되지 않은 경우 개체가 전체 IFA 카운트에 기록하고 빈 비정질 구조이나 현재 1-4 sporozoites (그림 3C)로 분류됩니다. 마찬가지로, Giardia와 같은 개체는 FITC와 DAPI 염색법뿐만 아니라 axonemes, 중간 기관, 그리고 핵 같은 DIC 특성에 관한 검토되고 Giardia의 cysts는 난형의 사과 – 그린 화려한 개체, 8 라운드가 – 5.에 의해 긴 18 μm의 – 15 μm의 밝게 강조 모서리 (그림 3D)와 폭. DAPI 자외선으로 Giardia의 포낭은 DAPI-부정적인 염색법, 또는 DAPI – 긍정적인 특성 (그림 3E) 전시됩니다. Cryptosporidium에 대해 설명한 것처럼 형광 객체는 같은 방식으로 전형 및 비정형 특징을위한 DIC을 면밀히 검토합니다.비정형 기능이 관찰되지 않으면 개체는 총 IFA 카운트에 기록하고 빈 함유 비정질 구조로서, 또는 현재의 내부 구조 (그림 3 층) 중 하나 이상의 유형으로 분류됩니다. 비정형 특징을 가지고 관찰되는 모든 유기체는 (OO) 낭종으로 계산해서는 안됩니다. 환경 시료의 현미경 분석은 자동 형광 또는 FITC-복합 백신 Cryptosporidium 및 / 또는 방지 Giardia 항체 1 교차 반응 있습니다 유기체가로 도전하실 수 있습니다. 그것은 분석가가 수생 미생물, Cryptosporidium 및 Giardia을 파악 경험을 쌓을 수있는 슬라이드를 검토 수십 잘 알고 있어야하는 것이 좋습니다. 최소한 세 (OO) 긍정적인 염색법 컨트롤 슬라이드에 cysts 전에 현미경의 모든 세션에 대한 특징으로한다. 품질 관리 표본 %의 우물을 결정하기 위해 (OO) cysts를 타서 수 있습니다계산을 사용하여 각 protozoan에 대한 보임 : (OO) 낭종 비율 복구 = ((QC 샘플 백작 – Unspiked 샘플로부터 세어) / 스파이크) × 100. 그림 1. 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 시스템의 그래픽 표현. 튜빙은 원조를 담고 색깔 것은 시스템의 조립입니다. 그림 2. Cryptosporidium 및 Giardia (OO) cysts 대표 형광 이미지. Cryptosporidium의 oocysts과 Giardia의 cysts는 FITC 분류 안티 Cryptosporidium / Giardia 항체 물들일되었다. 화살표, Giardia의 cysts, 화살촉, Cryptosporidium oocysts. 네 Cryptosporidium oocysts 여섯 Giardia의 cysts의 총 초점 비행기에서 발견되었다. 샘플 observ200X 배율 미만의 에드. . 특성화에 사용 Cryptosporidium oocysts 및 Giaridia의 cysts의 그림 3 대표 미세한 이미지 Cryptosporidium의 oocysts (- C가).. 뚜렷한, 스카이 블루 DAPI의 핵 (B)와 oocyst 당 1-4 sporozoites (S) (C)까지 포함하고 밝게 강조 가장자리 ()와 직경 구형 물체 4-6 μm의의 빛나는 사과 녹색의 FITC의 형광. Giardia의 cysts (D – F). 난형의 개체에 둥근 8의 빛나는 사과 녹색의 FITC 형광 – 5에 의한 길이 18 μm의 – 포 스카이 블루 DAPI의 핵 (E)까지 포함하고 밝게 강조 가장자리 (D)와 등 하나 이상의 뚜렷한 내부 구조와 폭 15 μm의 핵 등 (N), 중간 몸 (M) 및 또는 axonemes () (F). 흰색 화살표, 화려한 사과 녹색 형광 염색법의 Cryptosporidium의 oocysts 및 Giardia cysts walls, 흰 화살촉, DAPI 긍정적인 핵. 샘플 1000X 배율 하에서 관찰했다.