Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

Es bien sabido que las neuronas maduras en el sistema nervioso central (SNC) no se puede regenerar sus axones después de lesiones debidas a la capacidad disminuida intrínseca para apoyar el crecimiento axonal y un ambiente hostil en el ^1,2 SNC maduro. En contraste, las neuronas maduras en el sistema nervioso periférico (PNS) regenerar fácilmente después de las lesiones ^3. XXX raíz dorsal (DRG ganglionares) neuronas son bien conocidos para regenerar robustamente después de lesiones de nervios periféricos. Cada neurona DRG crece un axón del soma celular, que se ramifica en dos ramas: una rama axonal periférico que inerva objetivos periféricos y una rama central que se extiende a la médula espinal. Lesiones de los resultados DRG axones periféricos en la regeneración de axones sustancial, mientras que los axones centrales en la médula espinal regenerarse poco después de la lesión. Sin embargo, si la lesión axonal periférica se produce antes de la lesión de la médula espinal (un proceso llamado la lesión acondicionado), la regeneración de los axones centrales es greatly mejora ^4. Por otra parte, los axones de las neuronas DRG centrales comparten el mismo ambiente hostil como descendente corticoespinal axones en la médula espinal. En conjunto, es la hipótesis de que los mecanismos moleculares que controlan la regeneración de los axones de las neuronas DRG adultos pueden aprovecharse para mejorar la regeneración del SNC axón. Como resultado, adultos neuronas DRG se utilizan ahora ampliamente como un sistema modelo para estudiar el crecimiento axonal regenerativo ^5-7.

Aquí se describe un método de cultivo adulto DRG neurona que puede ser utilizado para el estudio genético de la regeneración axonal in vitro. En este ejemplo de un adulto las neuronas DRG están genéticamente manipulados a través de electroporación mediada por transfección de genes ^6,8. Al transfectar neuronas con ADN plásmido o si / shRNA, este enfoque permite a ambos ganancia y la pérdida de la función de los experimentos para investigar el papel de un gen de interés en el crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos. Cuando las neuronas son transfectadas con SI / shRNA, la proteína endógena es dirigidageneralmente agotada después de 3-4 días en cultivo, durante el cual el crecimiento del axón tiempo robusta ya ha ocurrido, por lo que los estudios de pérdida de la función sea menos eficaz. Para resolver este problema, el método aquí descrito incluye un paso de re-suspensión y re-chapado después de la transfección, que permite que los axones para volver a crecer a partir de las neuronas en la ausencia de la proteína específica. Por último, ofrecemos un ejemplo del uso de este modelo in vitro para estudiar el papel de una regeneración axonal asociada a la genética, c-Jun, en la mediación de crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos ^9.