Um<em> In vitro</em> Modelo para o estudo genético de regeneração do axônio usando cultivadas adultos do mouse dorsal neurônios do gânglio da raiz é descrito. O método inclui um passo re-suspension/re-plating para permitir re-crescimento axonal a partir de neurónios submetidos a manipulação genética. Esta abordagem é especialmente útil para a perda de função de estudos de regeneração axonal utilizando RNAi baseado knockdown proteína.
É bem conhecido que os neurónios maduros no sistema nervoso central (CNS) não pode regenerar os seus axónios após lesões devido a capacidade intrínseca diminuída para suportar o crescimento axonal e um ambiente hostil no CNS 1,2 madura. Em contraste, os neurónios maduros no sistema nervoso periférico (PNS) regenerar rapidamente após lesões 3. Adultos gânglio da raiz dorsal (DRG) neurónios são bem conhecidos para regenerar vigorosamente após lesões dos nervos periféricos. Cada neurônio DRG cresce um axônio da célula soma, que se divide em dois ramos: um ramo do axônio periférico inervação alvos periféricos e um ramo central se estende para a medula espinhal. Lesão dos DRG resultados periféricos axônios em regeneração do axônio substancial, enquanto os axônios centrais na medula espinhal regenerar mal após a lesão. No entanto, se a lesão periférica axonal ocorre antes da lesão da medula espinal (um processo denominado a lesão condicionado), a regeneração de axónios centrais é greatly melhorado 4. Além disso, os axónios dos neurónios centrais DRG partilham o mesmo ambiente hostil como decrescente axónios corticoespinhais na medula espinal. Juntos, é a hipótese de que os mecanismos moleculares que controlam a regeneração do axônio dos neurônios adultos DRG pode ser aproveitado para melhorar a regeneração do axônio do SNC. Como resultado, os neurónios DRG adultos são agora largamente utilizado como um sistema modelo para estudar o crescimento axonal regenerativo 5-7.
Aqui, descrevemos um método de cultura adulto neurónio de DRG que pode ser usado para o estudo genético de regeneração axonal in vitro. Neste modelo adulto neurônios DRG são geneticamente manipulados por meio de eletroporação transfecção mediada gene 6,8. Por transfecção de neurônios com DNA plasmídeo ou SI / shRNA, esta abordagem permite que as duas de ganho e perda de função de experimentos para investigar o papel de qualquer gene de interesse no crescimento do axônio dos neurônios DRG adultos. Quando os neurónios são transfectadas com SI / shRNA, a proteína endógena é orientadageralmente empobrecido após 3-4 dias em cultura, tempo durante o qual o crescimento axonal robusto já tenha ocorrido, tornando os estudos de perda de função-menos eficaz. Para resolver este problema, o método aqui descrito inclui um passo re-suspensão e re-plating após a transfecção, o que permite axónios de voltar a crescer a partir de neurónios na ausência da proteína alvo. Finalmente, fornecemos um exemplo da utilização deste modelo in vitro para estudar o papel de um gene axónio regeneração-associado, c-Jun, na mediação crescimento axonal de adulto DRG neurónios 9.
Neurónios DRG adultos regenerar os seus axónios robustamente após a lesão do nervo periférico in vivo e in vitro, proporcionando assim um sistema útil para estudar a regeneração axonal em animais adultos. In vitro cultura de neurónios DRG adultos se está a tornar um método largamente utilizado para investigar os mecanismos moleculares pelos quais axônio regeneração é regulada. O procedimento in vitro de neurônios adultos cultura do mouse DRG aqui apresentada p…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi suportado por concessões aos FZ do NIH (R01NS064288) e Craig H. Neilsen Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
MEM | Invitrogen | 11090-081 |
Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
Collagenase A | Roche | 10103578001 |
TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |