دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر
Summary
و<em> في المختبر</emيوصف> نموذج للدراسة الجينية لتجديد محور عصبي مثقف باستخدام الماوس الخلايا العصبية الظهرية جذر عقدة الكبار. الأسلوب يشمل خطوة re-suspension/re-plating للسماح محور عصبي إعادة نمو الخلايا العصبية التي تمر من التلاعب الجيني. هذا النهج هو مفيد وخاصة بالنسبة للخسارة من بين وظيفة دراسات من تجديد محور عصبي باستخدام رني القائم على ضربة قاضية البروتين.
Abstract
ومن المعلوم أن الخلايا العصبية الناضجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا يمكن تجديد المحاور العصبية الخاصة بهم بعد الإصابات بسبب تضاؤل القدرة الذاتية لدعم نمو محور عصبي وبيئة معادية في الجهاز العصبي المركزي 1،2 ناضجة. في المقابل، الخلايا العصبية الناضجة في النظام العصبي الطرفي (المحيطي) تجديد بسهولة بعد إصابة 3. ومن المعروف جيدا الكبار عقدة الجذر الظهري (DRG) لتجديد الخلايا العصبية بقوة بعد إصابات الأعصاب الطرفية. كل عصبون DRG ينمو 1 محور عصبي من سوما الخلية، التي الفروع إلى فرعين محواري: فرع الطرفية التعصيب أهداف الطرفية وفرع الوسطى تمتد إلى النخاع الشوكي. إصابة نتائج المحاور الطرفية DRG في تجديد محور عصبي كبير، في حين أن المحاور العصبية المركزية في النخاع الشوكي تجديد سيئة بعد وقوع الضرر. ومع ذلك، إذا كان الضرر الطرفية محواري يحدث قبل إصابة الحبل الشوكي (عملية تسمى الآفة تكييف)، والتجديد من المحاور المركزية greatlتحسن Y 4. وعلاوة على ذلك، فإن محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية DRG مشاركة في بيئة معادية لها نفس التنازلي المحاوير القشري في النخاع الشوكي. معا، هو الافتراض أنه يمكن تسخير الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الخلايا العصبية من محور عصبي DRG الكبار لتعزيز الجهاز العصبي المركزي تجديد محور عصبي. ونتيجة لذلك، يتم الآن الكبار الخلايا العصبية DRG المستخدمة على نطاق واسع بأنه نظام نموذجي لدراسة التجدد نمو محور عصبي 5-7.
نحن هنا وصف طريقة لثقافة الكبار الخلايا العصبية DRG التي يمكن استخدامها للدراسة الجينية لتجديد محور عصبي في المختبر. في هذا بالغ نموذج يتم التلاعب وراثيا الخلايا العصبية DRG عبر electroporation بوساطة ترنسفكأيشن الجينات 6،8. بواسطة transfecting الخلايا العصبية مع البلازميد أو الاشتراكية / shRNA، هذا النهج يمكن تحقيق مكاسب على حد سواء، وفقدان وظيفة من بين التجارب للتحقيق في دور الجينات أي فائدة من محور عصبي في نمو الخلايا العصبية من DRG الكبار. عندما يتم transfected الخلايا العصبية مع الاشتراكية / shRNA، البروتين المحلية المستهدفة هيالمنضب عادة بعد 3-4 أيام في الثقافة، وخلال الوقت الذي نمو محور عصبي قوي حدث بالفعل، مما يجعل من دراسات فقدان وظيفة من بين أقل فعالية. لحل هذه المشكلة، الطريقة الموصوفة هنا يتضمن خطوة اعادة التعليق وإعادة الطلاء، بعد ترنسفكأيشن، والذي يسمح لمحاور عصبية من الخلايا العصبية في حالة عدم وجود بروتين استهدفت تنمو من جديد. أخيرا، ونحن نقدم مثالا على استخدام هذا النموذج في المختبر لدراسة دور الجينات المرتبطة تجديد محور عصبي، ج يونيو، في التوسط في نمو الخلايا العصبية من محور عصبي DRG الكبار 9.
Protocol
Discussion
الكبار الخلايا العصبية DRG تجديد المحاور العصبية الخاصة بقوة بعد اصابة الأعصاب الطرفية في والمجراة في المختبر، وبالتالي توفير نظام مفيد لدراسة تجديد محور عصبي في الحيوانات البالغة. في ثقافة المختبر من الخلايا العصبية DRG الكبار أصبحت الطريقة المستخدمة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المنح لFZ من المعاهد الوطنية للصحة (R01NS064288) وكريغ H. مؤسسة نيلسون.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
