Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

Het is algemeen bekend dat volwassen neuronen in het centrale zenuwstelsel (CZS) kunnen niet hun axonen regenereren na blessures als gevolg van verminderde intrinsieke vermogen om axon groei en een vijandige omgeving in de volwassen CZS ^1,2 ondersteunen. In tegenstelling tot volwassen neuronen in het perifere zenuwstelsel (PNS) gemakkelijk te regenereren na blessures ^3. Volwassen dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen zijn goed bekend bij krachtig regenereren na perifere zenuwletsels. Elke DRG neuronen groeit een axon van de cel soma, met vestigingen in twee axonale bedrijfstakken: een perifere tak innerveren perifere doelen en een centrale vestiging zich uitstrekt tot in het ruggenmerg. Letsel van de DRG perifere axonen resulteert in een aanzienlijke regeneratie van axonen, dat de door centrale axonen in het ruggenmerg slecht regenereren na het letsel. Echter, als de perifere axonale schade optreedt voorafgaand aan het ruggenmerg (een proces genaamd de conditionering laesie), regeneratie van het centrum van axonen is greatly verbeterd ^4. Bovendien is de centrale axonen van DRG neuronen dezelfde vijandige omgeving als dalende corticospinale axonen in het ruggenmerg. Samen, wordt verondersteld dat de moleculaire mechanismen die regeneratie van axonen van de volwassen DRG neuronen kan worden aangewend om CNS regeneratie van axonen te verbeteren. Als gevolg daarvan zijn volwassen DRG neuronen nu op grote schaal gebruikt als een modelsysteem om te studeren regeneratieve axon groei van ^5-7.

Hier beschrijven een werkwijze voor volwassenen DRG neuron cultuur kan worden gebruikt voor genetische studie van axon regeneratie in vitro. In dit model volwassen DRG neuronen zijn genetisch gemanipuleerd via elektroporatie-gemedieerde gen transfectie ^6,8. Door transfecteren neuronen met DNA-plasmide of Si / shRNA, deze aanpak maakt zowel winst-en verlies-van-functie experimenten om te onderzoeken de rol van elk gen-of-interest in axon groei van volwassen DRG neuronen. Wanneer neuronen worden getransfecteerd met si / shRNA, de beoogde endogene eiwit ismeestal leeg is na het 3-4 dagen in cultuur, gedurende welke tijd robuuste axongroei al heeft plaatsgevonden, waardoor de verlies-van-functie studies minder effectief. Als oplossing voor dit probleem beschreven methode omvat een resuspensie en opnieuw uitplaten stap na transfectie, waardoor axons opnieuw groeien neuronen in afwezigheid van de gerichte eiwit. Tot slot geven we een voorbeeld van het gebruik van deze in vitro model om de rol van een axon regeneratie-geassocieerde gen, c-Jun, studeren in het bemiddelen axon groei van volwassen DRG neuronen ^9.