Steuern der Größe, Form und Stabilität der supramolekularen Polymeren in Wasser

Schema 1. Selbstorganisation von BTA-basierte Diskoten in Citratpuffer in kugelförmigen Aggregaten zeigen Durchmessern von etwa 5 nm, bei millimolaren Konzentrationen von Baustein. Eine Erhöhung der Ionenstärke durch die Zugabe von NaCl zu der Bildung von länglichen Stäben mit einem Durchmesser von etwa 3 nm und einer Länge von> 25 nm ist. Hier klicken, um größere Zahl kommen . 1. Vorbereiten einer BTA-Gd (III) DTPA-Lösungen für CD-Spektroskopie und Messung von Temperatur-abhängige CD-Spektren als Funktion der NaCl-Konzentration Vorbereiten einer 100 mM Citratpuffer (pH 6,0). Vorbereiten einer 100 mM Citratpuffer (pH 6,0) mit 2 M NaCl. Man löst 0,254 mg BTA-Gd (III)-DTPA (MW = 3184 g mol -1 •) in 10 ml 100 mM Citratpuffer, target Konzentration 8 • 10 -3 mM BTA-Gd (III)-DTPA. Beschallen die Lösung für 5 Minuten. In eine 1 cm UV-Küvette mit der Lösung und Messung eines CD-Spektrum von 230 bis 350 nm und eine CD-Abkühlungskurve bei der höchsten Intensität CD-Bande (zB λ = 269 nm) von 363 bis 283 K bei einer Geschwindigkeit von 1 K min – 1. In der gleichen Volumen von 2 M NaCl, gepuffert Lösung des Citrat gepufferte Lösung von BTA-Gd (III)-DTPA, um die Ionenstärke auf 1 M NaCl zu erhöhen, Verdünnen der diskotischen die Hälfte der Konzentration, Zielkonzentration 4 • 10 -3 mM BTA-Gd (III)-DTPA. Vortex die Lösung mit erhöhter Ionenstärke für 5 Minuten. Messen Sie eine CD-Spektrum von 230 bis 350 nm und einer CD Abkühlungskurve bei der höchsten Intensität CD-Bande von 363 bis 283 K bei einer Geschwindigkeit von 1 K min -1. 2. Die Montage der T-abhängigen CD Daten an ein Modell für T-abhängigHNO-Self-Assembly Die Roh-CD-Daten wurden in Origin 8.5 und normalisierte exportiert. Dies wurde durch die Definition der CD-Effekt bei der höchsten gemessenen Temperatur gleich 0 ist, und der CD-Effekt am niedrigsten gemessenen Temperatur gleich 1 gelöst. Da die Größe der CD-Wirkung ist proportional zu dem Grad der Aggregation 8 sind die normalisierte CD-Kurven proportional zum Grad der Aggregation. Die normalisierten Daten wurden mit Hilfe der nichtlinearen Kurvenanpassung Option in OriginPro 8.5 mit einem T-abhängige Self-Assembly-Modell von van der Schoot 8,9 abgeleitet. In diesem Modell wird eine Keimbildung und eine Dehnung Regelung aus. Zuerst wird der Grad der Aggregation in der Verlängerung Regelung (T <T E) ausgestattet war, unter Verwendung der folgenden Gleichung: Vor Gleichung enthält (neben der Variablen Temperatur, T, und der Grad der aggrgation, Φ n) drei Parameter, dh die Enthalpie der Dehnung h e, die Dehnung T e (die Temperatur, bei der die Selbstorganisation beginnt) und der Parameter Φ SAT, die eingeführt werden, um sicherzustellen, dass Φ n / Φ SAT macht wird nicht mehr als Einheit, die von der Einschränkung, dass der Grad der Aggregation nicht größer als eins folgt. Fitting macht die Enthalpie der Dehnung h E (J / mol) und der Dehnung T e (K), die Selbstorganisation der Moleküle für eine gegebene Konzentration zu charakterisieren. Bei der Montage sollte man Zurückhaltung gehorchte das ist, dass nur der Grad der Aggregation bei Temperaturen unterhalb von T e eingebaut werden sollte, da Gleichung 2.1 ist nur gültig in der Verlängerung Regimes werden. Als nächstes wird die experimentell gefundene Grad der Aggregation in derKeimbildung Regelung einsetzbar ist, werden unter Verwendung der folgenden Gleichung: Vor Gleichung enthält (neben den Variablen T und Φ n) vier Parameter, von denen bereits drei Gleichung 2.1 bestimmt wurden, dh die Enthalpie der Dehnung h e, die Dehnung T e und dem Parameter Φ SAT. Die einzige unbekannte Parameter ist die K a-Wert-Beschreibung der Kooperativität des Keimbildungsphase-, die durch Anpassung der experimentell ermittelten Grad der Aggregation für Temperaturen oberhalb von T e gefunden wird. 3. Vorbereiten BTA-Gd (III) DTPA-Lösungen für Transmissionselektronenmikroskopie und Visualisierung von supramolekularen Polymeren mittels Kryo-TEM Planen zwei Puffer: 100 mM Citratpuffer (pH 6,0) und 100 mM Citratpuffer (pH 6,0) wIth 5 M NaCl. Man löst 0,318 mg BTA-Gd (III)-DTPA (MW = 3184 g mol -1 •) in 0,1 ml jeder der hergestellten Puffer, Zielkonzentration 1 mM BTA-Gd (III)-DTPA. Die Probe Verglasung für kryogene TEM wird unter Verwendung eines automatisierten Roboter Verglasung (FEI Vitrobot Mark III) durchgeführt. CryoTEM Grids (R2 / 2 Quantifoil Jena Gitter aus Quantifoil Micro Tools GmbH) sind Plasma behandelten Oberfläche vor der Verglasung Verfahren mit Hilfe eines Cressington 208 Carbon Coater, der bei 5 mA für 40 s. Die wässrige Lösung wird dann auf dem Gitter beim Verglasen auf einem automatisierten FEI Vitrobot aufgebracht. Dies beinhaltet die Anwendung der Probe auf dem Gitter, Blotting von überschüssiger Flüssigkeit, um einen dünnen Film aus der wässrigen Lösung auf dem Gitter und anschließende Vitrifikation durch Eintauchen des Gitters sehr schnell in flüssigem Ethan zu schaffen. Nach dem Verglasen die Probe in flüssigen Stickstoff gehalten und manuell auf dem Autoloader Kassette übertragen, auch cooled mit flüssigem Stickstoff. Die Kassette wird dann in den Autoloader der TEM eingesetzt. Dies alles erfolgt manuell. Die CryoTEM Experimente werden auf der TU / e cryoTitan (FEI), (durchgeführt www.cryotem.nl ). Die TU / e cryoTitan ist mit einem Feldemissionsquelle (FEG), die bei 300 kV ausgestattet. Bilder wurden mit einem 2K x 2K Gatan CCD-Kamera mit einem Beitrag Spalte Gatan Energiefilter (GIF) ausgestattet. 4. 1 H-DOSY-NMR-Messungen der Sphärische Selbstorganisierte BTA-Gd (III)-DTPA bei niedriger Ionenstärke Herstellen einer 50 mM d 6-Succinat-Puffer in D 2 O ("pH 6,0 '), der Puffer wird durch Auflösen von d 6-Bernsteinsäure in D 2 O, gefolgt vom Einstellen des pH auf 6,0 mit 1 M ND 4 OD D 2 O. Die Endkonzentration von 50 mM Succinat wurde mit zusätzlichem D 2 O eingestellt Da Gd (III) ist stark paramagnetischeund 1 H-Signale dadurch erheblich erweitert werden, Gd (III) wurde für Y (III) substituiert ist. Man löst 2,98 mg BTA-Y (III)-DTPA (MW = 2979 g mol -1 •) in 1 ml eines 50 mM d 6-Succinat-Puffer in D 2 O ("pH 6,0), 1 mM Zielkonzentration BTA- Y (III)-DTPA. Die 1 H-DOSY-NMR-Messungen werden mit einem Varian Unity Inova 500 Spektrometer mit einem 5 mm-ID-PFG-Sonde der Firma Varian ausgestattet ist. Die DOSY-Experimente wurden unter Verwendung des DOSY One-Shot (Doneshot, Varian) Pulssequenz durchgeführt. Die 90-Grad-Puls und Mischzeiten wurden entsprechend angepasst. Die chemischen Verschiebungen wurden referenziert mit dem die chemische Verschiebung des 3 – (trimethylsilyl) Propionsäure-2, 2,3,3 – [D 4]-Natriumsalz (TMSP). Die Selbstdiffusion von HDO wurde verwendet, um die Messungen zu kalibrieren, es wird aus der Literatur bekannt, dass die Selbstdiffusion von HDO in D 2 O bei 298 K 19,0 × 10-9 m 2 ist </sup> • s -1. Als Referenz der Selbstdiffusion von HDO in D 2 O wurde in einer VARIAN 2 Hz D 2 O Standardprobe gemessen und kalibriert, um seine Standard-Wert. Das Modell verwendet, um den hydrodynamischen Radien R H der Aggregate zu berechnen ist die Stokes-Einstein-Relation für die Verbreitung eines kugelförmigen Teilchens. 5. Repräsentative Ergebnisse 1 H-NMR DOSY und SAXS-Messungen an BTA-M (III)-DTPA: kugelförmige Objekte in Citratpuffer Die ionischen Charakter der peripheren Gd (III)-Komplexe führt Frustration in der eindimensionalen Wachstum der diskotischen Monomere, deren Kern bestimmt ist, in gestreckten stabförmigen Aggregate zu polymerisieren. Das Gleichgewicht zwischen anziehenden und abstoßenden Wechselwirkungen steuert die Größe und die Form der Aggregate (Schema 2). Schema 2. Eine effektive Methode, um die Größe und die Form der Teilchen in Lösung zu bestimmen ist Synchrotronstrahlung kleinen Winkel Röntgenstreuung (SAXS). BTA-Gd (III)-DTPA wurde in einem Citratpuffer gelöst und die Kleinwinkeldiffraktogramme wurden aufgezeichnet und montiert in dem Bereich 0,01 <q <0,1 Å -1. Eine Neigung von nahezu null in der Niederdruck-q (q <0,06 Å -1) einen Mangel an Form-Anisotropie im Aggregat, was das Vorhandensein von kugelförmigen Gegenständen (1). Die Daten bei verschiedenen Konzentrationen gemessen wurden mit Hilfe einer homogenen monodispersen kugelförmigen Form Faktor, der zu einem berechneten Radius R von 3,2 nm auf. Die berechneten geometrischen Radius monomeren diskotischen BTA-Gd (III)-DTPA beträgt 3,0 nm, die das Vorhandensein von Aggregaten mit einem Seitenverhältnis schließen Anspruch 1 schlägt. <br /> Abbildung 1. Kleinwinkeldiffraktogramme für BTA-Gd (III)-DTPA in Citratpuffer (100 mM, pH 6) bei 0,5 und 1,0 mm (oben). DOSY-NMR von BTA-Y (III)-DTPA in 50 mM d 6-Succinat-Puffer bei 1,0 mm (unten). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen . Um ein weiterer Beweis für die Kugelgestalt und Nanometer-Größe der self-assembled Objekte bieten, führten wir ein H-Diffusion bestellt NMR-Spektroskopie (1 H-DOSY-NMR) (Abbildung 1). DOSY-NMR erlaubt die Bestimmung der Diffusionskoeffizienten von Aggregaten, aus denen die hydrodynamischen Radius (R H) berechnet werden können. Da Gd (III) ist stark paramagnetische und 1 H-Signale würde dadurch erheblich verbreitert werden, änderten wir Gd (III) für diamagnetische Y (III). Die Diffusionskoeffizienten der aggregierten diamagnetischen diskotischen Amphiphil in einem deuterierten Succinat-Puffer (50 mM, PH 6, c = 1 mM) wurde zu 0.69×10-10 m 2 s -1. Über die Stokes-Einstein-Relation, berechnen wir einen hydrodynamischen Radius R H von 2,9 nm für die diskrete Objekte von sphärischen Größe (Tabelle 1). Diese Größe ist in hervorragender Übereinstimmung mit dem Wert von SAXS-Daten für die BTA-Gd (III)-DTPA erhalten. BTA-M (III)-DTPA [MM] D t a [10 -10 m 2 s -1] R H a [Nm] R b [Nm] 1 0,69 2,9 3,2 ein aus DOSY, b aus SAXS Tabelle 1. Ergebnisse der SAXS und DOSY-Messungen für BTA-M (III)-DTPA. Kryo-TEM auf BTA-Gd (III)-DTPA: von kugelförmigen Gegenständen zu dem länglichen Nanostäbchen Ein weiterer Beweis für eine erfolgreiche Kontrolle über eindimensionalen Stapel Länge wurde von Cryo-TEM-Aufnahmen erhalten. Durch die Verglasung der wässrigen Lösungen kryogenen TEM bewahrt die strukturelle Morphologie der selbstorganisierten Aggregate und vermeidet Trocknen Affekte im Zusammenhang mit konventionellen TEM Probenvorbereitung. 2 (links) zeigt, dass BTA-Gd (III)-DTPA zu den erwarteten sphärischen Objekte mit einem Durchmesser von etwa 6 nm bei einer Konzentration von 1 mM, der die Ergebnisse von SAXS-Messungen und DOSY bestätigt. Nach diesen Erkenntnissen haben wir in der Lage, self-assembled Einzelobjekten, die als das Äquivalent von supramolekularen dendritischer Makromoleküle 10 zu erwirken. . Abbildung 2 Cryo-TEM-Aufnahmen für die BTA-Gd (III)-DTPA (links) 1 mm bei 298 K in Citratpuffer (100 mM, pH 6) verglast, stellt Maßstab 50 nm;(Rechts) 1 mM bei 298 K in Citratpuffer (100 mM, pH 6) und einer allgemeinen NaCl-Konzentration von 5 M verglast, stellt Maßstab 50 nm auf. Bisher haben wir nur in gepufferten Lösungen geringer Ionenstärke gearbeitet. Wenn jedoch elektrostatischen Abstoßungskräfte der peripheren M (III)-DTPA-Komplexe auf BTA-Gd (III)-DTPA sind am Anfang des verhinderten eindimensionalen Wachstum berechnet erwarteten wir, dass die Erhöhung der Ionenstärke des gepufferten Umgebung Verwendung eines inerten 1:1-Salz mit hoch hydratisierte Gegenionen, das Reduzieren der elektrostatischen Wechselwirkungen und somit eine andere Art von selbstorganisierten Aufgabe gebildet werden sollte. Im Citrat-Puffer mit 5 M NaCl wurde dieser Effekt in der Tat beobachtet (Abbildung 2, rechts). Die Bildung von hohem Aspektverhältnis stabförmigen supramolekularen Polymeren zeigt sich deutlich in Cryo-TEM-Aufnahmen bei hoher Ionenstärke beobachtet. Elektrostatische Abschirmung ist die wahrscheinlichste Erklärung für diese Befunde. Die Form ändert sich von einem SPHErische Aggregat von etwa 6 nm im Durchmesser, um längliche Stäbe mit einem Durchmesser von 6 nm und einer Länge von bis zu mehreren hundert Nanometern. CD-Messungen von BTA-Gd (III)-DTPA: Einschalten kooperativen self-assembly durch Erhöhung der Ionenstärke Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie misst die Differenz der Absorption zwischen links-und rechts-zirkular polarisiertes Licht. Wenn ein Objekt eine schraubenförmige bevorzugte Helixsinn hat links und rechts-zirkular polarisierte Licht wird in unterschiedlichem Maße absorbiert werden und somit, die zu einer CD-Effekt. Da die intermolekularen Wasserstoffbrücken zwischen aufeinanderfolgenden BTA-Gd (III)-DTPA innerhalb der Aggregate gebildet werden, werden in einer spiralförmigen Weise gefüttert und das Stereozentrum an der L-Phenylalanin-Rest begünstigt ein Helixsinn über den anderen, erwarten wir einen deutlichen CD Spektrum von der BTA-Gd (III)-DTPA basierende Aggregate 11,12. Darüber hinaus ist temperaturabhängig CD-Spektroskopie ein leistungsstarkesWerkzeug, um die Selbstorganisation Mechanismus der BTA-Gd (III)-DTPA Polymerisation beurteilen und erlaubt es, Schlüsse daraus zu ziehen auf die Stabilität der gebildeten Aggregate 13. Als ein Beispiel sind die Raumtemperatur CD-Spektren von BTA-Gd (III)-DTPA (8×10 -3 mM oder 4×10 -3 mM in 100 mM Citratpuffer) mit steigender Salzkonzentration (0 M NaCl bis 1,0 M NaCl) gegeben in 3A. Obwohl eine signifikant niedrigere Konzentration für die CD-Messungen angewendet wird, zeigt die klare Cotton-Effekt die Anwesenheit intakter Aggregate, auch in mikromolaren Konzentrationen. Die Form der CD-Spektrum Veränderungen bei Erhöhung der Salzkonzentration, die ein guter Indikator für reduzierte Wechselwirkungen an der Peripherie der Stapel und bessere Packung der diskotischen ist. Darüber hinaus werden die CD Abkühlungskurven der gleichen Lösungen (363 bis 283 K, gemessen bei λ = 269 oder 278 nm) zeigen deutliche Unterschiede in der Form (Abbildung 3B). Der APübergeordneten T E-Temperatur, bei der Aggregation beginnt-zu höheren Temperaturen bei höheren Salzkonzentration und einer zunehmend kooperativen Mechanismus, durch eine abrupte Erhöhung der CD-Wirkung aus, sichtbar wird. Während die Abkühlkurve bei 0 M NaCl wird am besten durch eine isodesmischen Self-Assembly-Prozess beschrieben, ist die Abkühlungskurve bei 1,0 M NaCl typisch für eine kooperative Selbstorganisation 14. Im ersteren Fall werden alle Assoziationskonstanten als gleich angenommen, während im letzteren Fall Selbstorganisation tritt in mindestens zwei Stufen besteht. Im ersten Schritt, muss ein "Kern" zu bilden, welche energetisch sehr ungünstig ist. Nach dem Abkühlen unter einen kritischen Polymerisationstemperatur folgt Dehnung und exponentielles Wachstum in supramolekularen Polymeren mit hohem Molekulargewicht. Die Quantifizierung der thermodynamischen Parameter der Selbstorganisation von BTA-Gd (III)-DTPA bei 0 und 1 M NaCl mit einem kooperativen Modell zeigt deutlich die Abnahme der K <sub> a, die Aktivierung der dimensionslose Konstante 8 ist. Niedrigere Werte für K a zeigen einen höheren Grad an Kooperativität in den Self-Assembly-Prozess, der bei der Bildung von stark verlängerten supramolekulare Polymere wie in Cryo-TEM beobachtet ausgedrückt wird. BTA-Gd (III)-DTPA C NaCl K a 8 x 10 -3 mM 0 M 5 10 -2 4 x 10 -3 mM 1 M 1 10 -4 Tabelle 2. Grad der Kooperativität von K geäußert in der temperaturabhängigen Selbstorganisation von BTA-Gd (III)-DTPA in Abhängigkeit von der NaCl-Konzentration (C NaCl). Abbildung 3. BTA-Gd (III)-DTPA in einer 100 mM Citratpuffer (c = 8 x 10 -3 mM bei niedriger Ionenstärke und 4 x 10 -3 mM bei hoher Ionenstärke) A] CD-Spektren bei 293 K in Abhängigkeit von der Ionenstärke aufgezeichnet , c = 0 NaCl M – 1,0 M, das molare Elliptizität Δε wird wie folgt berechnet: Δε = CD-Effekt / (CXL), wobei c die Konzentration von BTA in mol L -1 und l die optische Weglänge in cm , B] Entsprechende CD Abkühlungskurven bei λ = 269 nm gemessen für 0 M NaCl und 278 nm für 1 M NaCl-Lösungen, ausgedrückt als der Grad der Aggregation Φ n in Abhängigkeit von der NaCl-Konzentration c NaCl = 0 m – 1,0 M, Φ n wird durch Dividieren der gemessenen CD-Effekt durch die maximale CD-Wirkung berechnet.