Het beheersen van de grootte, vorm en stabiliteit van de supramoleculaire polymeren in water

Schema 1. Autoassemblage van BTA gebaseerde discotics in citraatbuffer sferische aggregaten met een diameter van ongeveer 5 nm, bij millimolair concentraties bouwsteen. Verhoging van de ionensterkte door toevoeging van NaCl in de vorming van langwerpige staven met een diameter van ongeveer 3 nm en de lengte> 25 nm. klik hier grotere figuur zien . 1. Het voorbereiden van een BTA-Gd (III) DTPA Oplossingen voor CD-spectroscopie en meting van temperatuur-afhankelijke CD Spectra als functie van de NaCl-concentratie Bereid een 100 mM citraat buffer (pH 6,0). Bereid een 100 mM citraat buffer (pH 6,0) met 2 M NaCl. Los 0,254 mg BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol -1) in 10 ml 100 mM citraatbuffer tArget concentratie 8 • 10 -3 mM van BTA-Gd (III) DTPA. Sonificeer de oplossing 5 minuten. Vul een 1 cm cuvet UV de oplossing en meet een CD spectrum 230-350 nm en een CD koelingscurve de zwaarst CD band (bijvoorbeeld λ = 269 nm) 363 tot 283 K bij een snelheid van 1 min K – 1. Voeg hetzelfde volume van 2 M NaCl gebufferd voor de citraat gebufferde oplossing van BTA-Gd (III) DTPA om de ionsterkte te verhogen tot 1 M NaCl, verdunnen discotics de helft van de concentratie, doelconcentratie 4 • 10 -3 mM BTA-Gd (III) DTPA. Vortex de oplossing met grotere ionensterkte gedurende 5 minuten. Meet CD spectrum 230-350 nm en een CD koelingscurve de zwaarst CD band 363 tot 283 K bij een snelheid van 1 K min -1. 2. Montage van de T-afhankelijke CD gegevens naar een model voor T-afhankelijkent Zelf-assemblage De ruwe cd-gegevens werden geëxporteerd naar Origin 8,5 en genormaliseerd. Dit werd bereikt door het definiëren van de CD effect op de hoogst gemeten temperatuur gelijk aan 0 en CD effect op laagste gemeten temperatuur gelijk aan 1. Aangezien de grootte van de CD-effect is evenredig met de mate van aggregatie 8 de genormaliseerde CD-curven evenredig met de mate van aggregatie. De genormaliseerde gegevens werden gemonteerd met behulp van de niet-lineaire curve fit-optie in OriginPro 8,5 met behulp van een T-afhankelijke zelf-assemblage model afgeleid door van der Schoot 8,9. In dit model worden een nucleatie en een rek regime onderscheiden. Eerst de mate van aggregatie van de rek regeling (T <T e) kreeg, waarbij de volgende vergelijking: Boven vergelijking bevat (naast de variabele temperatuur T, en de mate van aggregation, Φ n) drie parameters, namelijk de enthalpie van rek h e, de rek temperatuur T e (de temperatuur waarbij het ​​zelf-assemblage begint) en de parameter Φ SAT, die wordt geïntroduceerd om Φ n / Φ zat doet niet hoger zijn dan de eenheid, die voortvloeit uit de beperking dat de mate van aggregatie kan niet hoger zijn dan de eenheid. Montage maakt de enthalpie van rek h e (J / mol) en de rek temperatuur T e (K) dat de zelf-assemblage van de moleculen van een bepaalde concentratie te karakteriseren. Bij de montage moet men terughoudendheid in acht worden genomen en dat is dat alleen de mate van aggregatie bij temperaturen onder T E moet worden gemonteerd, omdat vergelijking 2.1 is alleen geldig in de rek-regime. Vervolgens wordt de experimenteel gevonden aggregatiegraad in denucleatie regime kan worden gemonteerd met behulp van de volgende vergelijking: Bovenstaande vergelijking bevat (naast de variabelen T en Φ n) vier parameters waarvan er al drie werden bepaald met vergelijking 2.1, dat wil zeggen de enthalpie van rek h e, de rek temperatuur T e en de parameter Φ SAT. De enige onbekende parameter is de K een waarde waarin de coöperativiteit van kiemvorming fase die wordt verkregen door het aanbrengen van de experimenteel gevonden mate van aggregatie bij temperaturen boven T e. 3. Voorbereiden van BTA-Gd (III) DTPA Oplossingen voor Transmissie Elektronen Microscopie en Visualisatie van supramoleculaire polymeren via cryogene TEM Bereid twee buffers: 100 mM citraat buffer (pH 6,0) en 100 mM citraat buffer (pH 6,0) wi 5 M NaCl. Los 0,318 mg BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol -1) in 0,1 ml van elk van de bereide buffers, doelconcentratie 1 mM BTA-Gd (III) DTPA. Het monster verglazing voor cryogene TEM wordt uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerd verglazing robot (FEI Vitrobot Mark III). CryoTEM grids (R2 / 2 Quantifoil Jena roosters van Quantifoil Micro Extra GmbH) zijn oppervlakte plasma voorafgaand aan de verglazing procedure met behulp van een Cressington 208 koolstofbedamper werkend bij 5 mA voor 40 s behandeld. De waterige oplossing wordt dan op het raster in verglazing op een geautomatiseerde FEI Vitrobot. Dit impliceert de toepassing van het monster op het rooster blotting van overtollige vloeistof van een dunne film van de waterige oplossing op het rooster en vervolgens door dompelen verglazing het raster snel in vloeibare ethaan maken. Na verglazing van het monster wordt gehouden in vloeibare stikstof en handmatig overgebracht autoloader cassette ook Cooled met vloeibare stikstof. De cassette wordt dan in de autoloader van TEM. Dit gebeurt met de hand. De cryoTEM experimenten worden uitgevoerd op de TU / e cryoTitan (FEI), ( www.cryotem.nl ). De TU / e cryoTitan is voorzien van een Field Emissie Gun '(FEG) werkt bij 300 kV. Beelden werden opgenomen met een 2k x 2k Gatan CCD-camera uitgerust met een post kolom Gatan Energie Filter (GIF). 4. 1 H-DOSY NMR-metingen van sferische zelf-geassembleerde BTA-Gd (III) DTPA bij lage ionsterkte Bereid een 50 mM 6-d succinaatbuffer in D2O (pH 6,0), de buffer wordt bereid door d6-barnsteenzuur in D2O, gevolgd door de pH op 6,0 met 1 M ND 4 OD in D 2 O. De eindconcentratie van 50 mM barnsteenzuur werd met extra D 2 O. Aangezien Gd (III) is zeer paramagnetischen 1 H signalen daardoor aanzienlijk wordt verbreed, Gd (III) werd vervangen Y (III). Los 2,98 mg BTA-Y (III) DTPA (MW = 2979 g • mol -1) in 1 ml 50 mM 6-d succinaatbuffer in D2O (pH 6,0), 1 mM doelconcentratie BTA- Y (III) DTPA. De 1H-NMR DOSY metingen worden uitgevoerd op een Varian eenheid Inova 500 spectrometer voorzien van een 5 mm ID-PFG probe van Varian. De DOSY experimenten werden uitgevoerd met behulp van de DOSY one-shot (Doneshot, Varian) pulssequentie. De 90 graden puls und mengtijden werden aangepast. Chemische verschuivingen werden verwezen via chemische verschuiving van de 3 – (trimethylsilyl) propionzuur-2, 2,3,3 – [D 4]-natriumzout (TMSP). De zelf-diffusie van HDO werd gebruikt om de metingen kalibreren; is uit de literatuur bekend dat de eigen diffusie van HDO in D2O bij 298 K 19,0 x 10-9 m 2 </sup> • s -1. Als referentie, de zelf-verspreiding van HDO in D 2 O werd gemeten in een Varian 2 Hz D 2 O standaard monster en gekalibreerd om de standaard waarde. Het model wordt gebruikt om de hydrodynamische straal R H van de aggregaten te berekenen is de Stokes-Einstein relatie voor de verspreiding van een bolvormig deeltje. 5. Representatieve resultaten 1H-NMR DOSY en SAXS metingen BTA-M (III)-DTPA: bolvormige voorwerpen citraatbuffer De ionisch karakter van de perifere Gd (III) complexen introduceert frustratie in de een-dimensionale groei van de discotische monomeren waarvan de kern is ontworpen om te polymeriseren in langwerpige staaf-achtige aggregaten. Het evenwicht tussen aantrekkelijk afstotend bepaalt de grootte en de vorm van de aggregaten (Schema 2). Schema 2. Een krachtige techniek om de grootte en de vorm van deeltjes in oplossing te bepalen, is synchrotronbron kleine hoek X-ray scattering (SAXS). BTA-Gd (III)-DTPA werd opgelost in een citraatbuffer-oplossing en SAXS profielen opgenomen en aangebracht in het gebied 0,01 <q <0,1 A -1. Een helling vrijwel nul in de laag q regio (q <0,06 Å -1) wijst op een gebrek van vormanisotropie in totaal, suggereert de aanwezigheid van bolvormige voorwerpen (figuur 1). De gegevens bij verschillende concentraties was uitgerust met een homogene monodisperse bolvorm factor voor een berekend straal R van 3,2 nm. De berekende geometrische straal van monomere discotische BTA-Gd (III)-DTPA 3,0 nm, de aanwezigheid van aggregaten met een aspect verhouding van 1 voorstelt. <br /> Figuur 1. SAXS profielen BTA-Gd (III)-DTPA in citraat buffer (100 mM, pH 6) bij 0,5 en 1,0 mM (boven). DOSY NMR van BTA-Y (III)-DTPA in 50 mm D 6-succinaatbuffer bij 1,0 mm (onder). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Om verder bewijs voor de sferische vorm en nanometer grootte van de zelfgeassembleerde voorwerpen voorzien, voerden we een H diffusie-volgorde NMR spectroscopie (1H-NMR DOSY) (figuur 1). DOSY-NMR maakt de bepaling van de diffusiecoëfficiënten van aggregaten van de hydrodynamische straal (R H) worden berekend. Aangezien Gd (III) is zeer paramagnetische en 1 H signalen zou er aanzienlijk worden vergroot, we veranderd Gd (III) voor diamagnetisch Y (III). De diffusiecoëfficiënten van de geaggregeerde diamagnetisch discotische amfifiele in een gedeutereerd succinaat buffer (50 mM, PH 6, c = 1 mM) werd bepaald op 0.69×10-10 m 2 s-1. Via de Stokes-Einstein relatie berekenen we een hydrodynamische straal R H 2,9 nm voor de afzonderlijke voorwerpen van sferische omvang (Tabel 1). Dit formaat is zeer goed overeen met de waarde verkregen uit SAXS gegevens voor BTA-Gd (III)-DTPA. BTA-M (III)-DTPA [MM] D t een [10 10 m 2 s-1] R H a [Nm] R b [Nm] 1 0,69 2,9 3,2 een van DOSY b van SAXS Tabel 1. Resultaten van SAXS en DOSY metingen voor BTA-M (III)-DTPA. Cryo-TEM op BTA-Gd (III)-DTPA: van bolvormige objecten om langwerpige nanorods Verder bewijs voor een succesvolle controle over de een-dimensionale stapel lengte werd verkregen van cryo-TEM microfoto. Door de verglazing van de waterige oplossingen cryogene TEM blijft de structurele morfologie van de zelfgeassembleerde aggregaten en voorkomt drogen affecten verband met conventionele TEM prepareren. Figuur 2 (links) blijkt dat BTA-Gd (III)-DTPA produceert de verwachte bolvormige voorwerpen met diameters bijna 6 nm in een 1 mM concentratie die de resultaten van metingen SAXS en DOSY bevestigd. Volgens deze bevindingen, zijn we in staat om zelf samengevoegde afzonderlijke objecten die kunnen worden beschouwd als de supramoleculaire equivalent van dendritische macromoleculen 10 te verkrijgen. . Figuur 2 Cryo-TEM beelden voor BTA-Gd (III)-DTPA (links) 1 mM gesinterde bij 298 K in citraat buffer (100 mM, pH 6), schaalstaaf is 50 nm;(Rechts) 1 mM gesinterde bij 298 K in citraat buffer (100 mM, pH 6) en dat de NaCl concentratie van 5 M, schaalstaaf is 50 nm. Tot dusver hebben we alleen gewerkt in gebufferde oplossingen met een lage ionische sterkte. Indien elektrostatische afstotende krachten van de perifere geladen M (III)-DTPA complexen op BTA-Gd (III)-DTPA zijn aan de basis van de gefrustreerde een-dimensionale groei verwachtten we dat het verhogen van de ionische sterkte van de gebufferde milieu met een inert 1:1 zout met zeer gehydrateerde tegenionen dient minder elektrostatische interacties en dus een ander type zelfgeassembleerde object worden gevormd. In citraatbuffer met 5 M NaCl daartoe inderdaad waargenomen (figuur 2, rechts). De vorming van hoge aspectverhouding staafvormige supramoleculaire polymeren duidelijk waargenomen bij cryo-TEM microfoto bij hoge ionische sterkte. Elektrostatische screening is de meest waarschijnlijke verklaring voor deze bevinding. De vorm verandert van een spherical totaal van ongeveer 6 nm in diameter langwerpige staven met een diameter van 6 nm en de lengte van maximaal enkele honderden nanometer. CD metingen van BTA-Gd (III)-DTPA: aan coöperatieve zelfassemblage door verhoging van de ionensterkte Circulaire dichroïsme (CD) spectroscopie meet het verschil in absorptie tussen links-en rechtshandig circulair gepolariseerd licht. Wanneer een schroeflijnvormige object een voorkeursuitvoeringsvorm schroeflijnvormige zin heeft links en rechts circulair gepolariseerd licht wordt geabsorbeerd in verschillende mate dus waardoor een CD-effect. Sinds de intermoleculaire waterstofbruggen gevormd tussen opeenvolgende BTA-Gd (III)-DTPA in de aggregaten, worden opgesteld in een spiraalvormige mode en de stereogene centrum op de L-fenylalanine-groep is voorstander van een spiraalvormige zin boven de andere, verwachten we een duidelijke CD spectrum van BTA-Gd (III)-DTPA gebaseerde aggregaten 11,12. Bovendien temperatuurafhankelijke CD spectroscopie is een krachtigegereedschap de zelfassemblage mechanisme van BTA-Gd (III)-DTPA polymerisatie kan beoordelen en afleiden conclusies op de stabiliteit van de gevormde aggregaten 13. Als bijvoorbeeld de temperatuur CD spectra van BTA-Gd (III)-DTPA (8×10 3 mm of 4×10 3 mm in een 100 mM citraatbuffer) met toenemende zoutconcentratie (0 M NaCl tot 1,0 M NaCl) die in Figuur 3A. Hoewel een aanzienlijk lagere concentratie wordt toegepast voor de CD metingen duidelijke Cotton effect geeft de aanwezigheid van intacte aggregaten, zelfs bij micromolair concentraties. De vorm van de CD spectrum verandert bij toenemende zoutconcentratie, een goede indicatie voor minder interacties aan de omtrek van de stapels en een betere verpakking van de discotics. Bovendien CD koeling krommen van de oplossingen (363 tot 283 K, gemeten bij λ = 269 of 278 nm) vertonen duidelijke verschillen in vorm (Figuur 3B). Het apouder T e-de temperatuur waarbij aggregatie begint-verschuift naar hogere temperaturen hogere zoutconcentratie en steeds samenwerkingsmechanisme, gekenmerkt door een plotselinge verhoging van de CD-effect blijkt. Dat de koeling curve 0 M NaCl best beschreven door een isodesmic zelfassemblage proces de koelingscurve 1,0 M NaCl typisch is voor een coöperatieve zelf assemblage 14. In het eerste geval worden alle associatie constanten als gelijk terwijl in het laatste geval zelfassemblage optreedt ten minste twee fasen. In de eerste stap een "kern" worden gevormd, die is energetisch zeer ongunstig. Na afkoeling beneden een kritische polymerisatietemperatuur, rek en exponentiële groei in supramoleculaire polymeren met een hoog molecuulgewicht volgt. Het kwantificeren van de thermodynamische parameters van de zelf-assemblage van BTA-Gd (III)-DTPA bij 0 en 1 M NaCl met behulp van een coöperatief model ondubbelzinnig blijkt dat daling van de K <sub> a, die de dimensieloze activering constant 8. Lagere waarden K een duiden een hogere coöperativiteit in de zelfassemblage proces, uitgedrukt in de vorming van zeer langgerekte supramoleculaire polymeren zoals waargenomen in cryo-TEM. BTA-Gd (III)-DTPA C NaCl K een 8 x10 -3 mm 0 M 5 10 -2 4 x 10 -3 mm 1 M 1 10 -4 Tabel 2. Mate van coöperativiteit uitgedrukt K een in de temperatuurafhankelijke zelfassemblage van BTA-Gd (III)-DTPA als functie van de NaCl concentratie (C NaCl). Figuur 3. BTA-Gd (III)-DTPA in 100 mM citraatbuffer (c = 8 x10 3 mm bij lage ionensterkte en 4 x10 3 mm hoog ionensterkte) A] CD-spectra bij 293 K als functie van de ionensterkte , c = 0 M NaCl – 1,0 M, de molaire ellipticiteit Δε wordt als volgt berekend: Δε = CD-effect / (CXL) waarin c de concentratie in mol BTA L -1 en l de optische weglengte in cm ; B] Overeenkomstige CD koeling krommen gemeten bij λ = 269 nm voor 0 M NaCl en 278 nm voor 1 M NaCl oplossingen uitgedrukt in de mate van aggregatie Φ n als functie van de NaCl concentratie c = 0 M NaCl – 1,0 M, Φ n wordt berekend door de gemeten CD-effect door de maximale CD-effect.