Contrôle de la taille, la forme et la stabilité des polymères supramoléculaires dans l'eau

Schéma 1. Auto-assemblage de BTA à base discotics dans un tampon citrate dans agrégats sphériques présentant un diamètre d'environ 5 nm, à des concentrations millimolaires de bloc de construction. L'augmentation de la force ionique par l'addition des résultats de NaCl dans la formation de tiges allongées avec un diamètre d'environ 3 nm et longueur> 25 nm. Cliquez ici pour agrandir la figure . 1. Préparation d'un BTA-Gd (III) Solutions DTPA pour la spectroscopie de CD et la mesure des spectres CD dépendant de la température en tant que fonction de la concentration de NaCl Préparer un tampon de 100 mM de citrate (pH 6,0). Préparer un tampon à 100 mM de citrate (pH 6,0) avec 2 M de NaCl. Dissoudre 0,254 mg de BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol -1) dans 10 ml de 100 mM de tampon citrate, target concentration 8 • 10 -3 mm de BTA-Gd (III) DTPA. Sonication de la solution pendant 5 minutes. Remplir une cuvette de 1 cm UV avec la solution et mesurer un spectre de CD de 230 à 350 nm et une courbe de refroidissement CD à la bande la plus forte intensité de CD (par exemple X = 269 nm) 363 à 283 K à une vitesse de 1 K min – 1. Ajouter le même volume de 2 M de NaCl tamponnée solution au citrate solution tamponnée de BTA-Gd (III) DTPA afin d'augmenter la force ionique à 1 M de NaCl, diluant les discotics à la moitié de la concentration, la concentration cible 4 • 10 -3 mM de BTA-Gd (III) DTPA. Vortex la solution de force ionique augmentée pendant 5 minutes. Remesurer un spectre de CD de 230 à 350 nm et une courbe de refroidissement CD à la bande la plus forte intensité de CD de 363 à 283 K à une vitesse de 1 min -1 K. 2. Montage des CD de données T-dépendantes à un modèle de T-dépendentent Auto-assemblage Les données de CD premières ont été exportées dans l'origine de 8,5 et normalisée. Ce a été obtenu en définissant l'effet de CD à la température la plus élevée mesurée comme étant égale à 0, et l'effet de CD à la température plus basse que mesurée égale à 1. Depuis la grandeur du CD-effet est proportionnelle au degré d'agrégation 8, les normalisées CD-courbes sont proportionnelles au degré d'agrégation. Les données normalisées ont été montés avec l'option courbe non linéaire ajustement dans OriginPro 8,5 en utilisant un T-dépendante auto-assemblage modèle dérivé par van der Schoot 8,9. Dans ce modèle, une nucléation et un régime d'allongement se distinguent. D'abord le degré d'agrégation dans le régime de l'allongement (T <T e) a été équipé, en utilisant l'équation suivante: Équation ci-dessus contient (en regard de la température variable, T, et le degré de aggrgation, des Φ n) trois paramètres; entalpie d'allongement h e, l'allongement de température T e (la température à laquelle l'auto-assemblage commence) et le paramètre Φ SAT, qui est introduit pour assurer que Φ n / Φ t sam. dépasse pas l'unité, qui découle de la contrainte que le degré d'agrégation ne peut pas dépasser l'unité. Montage rend l'enthalpie de l'allongement h e (J / mol) et l'allongement de température T e (K) qui caractérisent l'auto-assemblage des molécules pour une concentration donnée. Lors du montage, un dispositif de retenue doit être obéi, qui est que seul le degré d'agrégation à des températures inférieures à T e doit être installé, puisque l'équation 2.1 est valable uniquement dans le régime de l'allongement. Ensuite, le degré d'agrégation constaté expérimentalement dans lerégime nucléation peut être monté, en utilisant l'équation suivante: Au-dessus de l'équation contient (à côté des variables de T et Φ n) quatre paramètres dont déjà trois ont été déterminées avec l'équation 2.1; c.-à-l'enthalpie de l'allongement h e, l'allongement de température T e et le paramètre Φ SAT. Le seul paramètre inconnu est le K une valeur décrivant la coopérativité-de la nucléation de phase qui se trouve en ajustant le degré d'agrégation constaté expérimentalement pour des températures supérieures T e. 3. Préparation BTA-Gd (III) Solutions DTPA pour microscopie électronique en transmission et visualisation des polymères supramoléculaires par cryogénique TEM Préparer deux tampons: un tampon 100 mM de citrate (pH 6,0) et une zone tampon de 100 mM de citrate (pH 6,0) wvec 5 M de NaCl. Dissoudre 0,318 mg de BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol -1) dans 0,1 mL de chacune des tampons préparés, la concentration cible de 1 mM de BTA-Gd (III) DTPA. La vitrification échantillon pour TEM cryogénique est effectuée en utilisant un robot automatisé de vitrification (DFI Vitrobot Mark III). Grilles CryoTEM (R2 / 2 Quantifoil grilles de Iéna Quantifoil micro GmbH Outil) sont traitées en surface par plasma avant la procédure de vitrification en utilisant une coucheuse exploitation Cressington 208 carbone à 5 mA pendant 40 s. La solution aqueuse est ensuite appliqué sur la grille lors de vitrification sur un système automatisé Vitrobot FEI. Cette implique l'application de l'échantillon sur la grille, buvard de liquide en excès pour créer un film mince de la solution aqueuse sur la grille et la vitrification subséquente par trempage de la grille très rapidement dans l'éthane liquide. Après la vitrification de l'échantillon est conservé dans l'azote liquide et transférée manuellement sur la cassette chargeur automatique, également cooled avec l'azote liquide. La cassette est ensuite inséré dans l'autochargeur de la TEM. Tout cela se fait manuellement. Les expériences sont effectuées sur cryoTEM la TU / e cryoTITAN (FEI), ( www.cryotem.nl ). Le cryoTITAN TU / e est équipé d'un pistolet à émission de champ (FEG) fonctionnant à 300 kV. Les images ont été enregistrées en utilisant une 2k x 2k caméra CCD Gatan équipée d'un poste colonne Gatan filtre d'énergie (GIF). 4. 1 H-RMN DOSY mesures de sphérique auto-assemblés BTA-Gd (III) DTPA à faible force ionique Préparer un mM 50 d 6-succinate tampon dans D 2 O («pH 6,0 '); le tampon est préparée en dissolvant d 6-acide succinique dans D 2 O, suivie par l'ajustement du pH à 6,0 en utilisant une M ND 4 OD D 2 O. La concentration finale de 50 mM succinate a été ajusté avec plus O. D 2 Depuis Gd (III) est très paramagnétiqueet 1 H signaux seraient ainsi considérablement élargi, Gd (III) a été remplacé par Y (III). Dissoudre 2,98 mg de BTA-Y (III) DTPA (MW = 2979 g • mol -1) dans 1 ml de 50 mM d 6-succinate de mémoire tampon dans D 2 O («pH 6,0 '), la concentration cible de 1 mM BTA- Y (III) du DTPA. Les 1 H-DOSY mesures RMN sont réalisées sur une Varian Inova 500 équipé d'un spectromètre de 5 mm ID-PFG sonde de Varian. Les expériences ont été réalisées DOSY l'aide de la DOSY one-shot (Doneshot, Varian) séquence d'impulsions. Les 90 fois le degré de mélange ont été und impulsions adaptées en conséquence. Déplacements chimiques sont référencées à l'aide du déplacement chimique de l'acide 3 – (triméthylsilyl)-2 propionique, 2,3,3 – [D 4] sel de sodium de l'acide (TMSP). L'auto-diffusion de HDO a été utilisé pour étalonner les mesures, il est connu de la littérature que l'auto-diffusion de HDO dans D 2 O à 298 K est de 19,0 × 10-9 m 2 </sup> • s -1. Comme une référence, l'auto-diffusion de HDO dans D 2 O a été mesurée dans un VARIAN 2 Hz échantillon D 2 O standard et calibré à sa valeur standard. Le modèle utilisé pour calculer la hydrodynamique rayons R H des agrégats est le rapport de Stokes-Einstein pour la diffusion d'une particule sphérique. 5. Les résultats représentatifs 1 H-RMN et DOSY mesures SAXS sur BTA-M (III)-DTPA: objets sphériques dans un tampon citrate Le caractère ionique des périphériques Gd (III) introduit dans la croissance de frustration unidimensionnelle des monomères discotiques dont le noyau est conçu pour polymériser en forme de tige allongées agrégats. L'équilibre entre les interactions attractives et répulsives de contrôler la taille et la forme des agrégats (schéma 2). Schéma 2. Une technique puissante pour déterminer la taille et la forme de particules en solution est source synchrotron X aux petits angles des rayons (SAXS). BTA-Gd (III)-DTPA a été dissous dans une solution tampon de citrate et les profils SAXS ont été enregistrées et monté dans la région 0,01 <q <0,1 Å -1. Une pente se rapprochant de zéro dans la région à faible q (q <0,06 Å -1) indique une absence de anisotropie de forme dans l'ensemble, ce qui indique la présence d'objets sphériques (figure 1). Les données mesurées à des concentrations différentes ont été ajustées en utilisant un facteur homogène monodisperse forme sphérique conduisant à un rayon calculé, R, de 3,2 nm. Le rayon géométrique calculée de monomère discotique BTA-Gd (III)-DTPA est de 3,0 nm, ce qui suggère la présence d'agrégats avec un aspect ratio proche de 1. <br /> Figure 1. Profils SAXS pour BTA-Gd (III)-DTPA dans un tampon citrate (100 mM, pH 6) à 0,5 et 1,0 mM (en haut). DOSY RMN de BTA-Y (III)-DTPA dans 50 mM d 6-succinate tampon à 1,0 mM (en bas). Cliquez ici pour agrandir la figure . Afin de fournir une preuve supplémentaire de la forme sphérique et de taille nanométrique des objets auto-assemblés, nous avons effectué 1 H de diffusion-commandé la spectroscopie RMN (1 H-RMN DOSY) (Figure 1). DOSY-RMN permet de déterminer les coefficients de diffusion d'agrégats, à partir de laquelle le rayon hydrodynamique (R H) peut être calculé. Depuis Gd (III) est très paramagnétique et 1 H signaux seraient ainsi considérablement élargi, nous avons changé de Gd (III) pour diamagnétique Y (III). Les coefficients de diffusion de l'amphiphile diamagnétique agrégé discotique dans un tampon succinate deutéré (50 mM, PH 6, c = 1 mM) a été déterminée comme étant 0.69×10-10 m 2 s -1. Via la relation de Stokes-Einstein, nous calculons une hydrodynamique rayon R H de 2,9 nm pour les objets discrets de dimension sphérique (tableau 1). Cette taille est en excellent accord avec la valeur obtenue à partir des données SAXS pour BTA-Gd (III)-DTPA. BTA-M (III)-DTPA [Mm] D t une [10 -10 m 2 s -1] R H une [Nm] R b [Nm] 1 0,69 2.9 3.2 une de DOSY; b partir SAXS Résultats Tableau 1. De SAXS et des mesures DOSY pour BTA-M (III)-DTPA. Cryo-TEM sur BTA-Gd (III)-DTPA: à partir d'objets sphériques allongées nanotiges Une preuve supplémentaire de contrôle efficace sur toute la longueur pile unidimensionnel a été obtenu à partir de cryo-TEM micrographies. En raison de la vitrification des solutions aqueuses cryogénique TEM conserve la morphologie structurelle des agrégats auto-assemblées et évite de séchage affecte lié à la préparation d'échantillon TEM classique. Figure 2 (à gauche) montre que la BTA-Gd (III)-DTPA produit le sphérique prévue objets dont le diamètre est près de 6 nm à une concentration de 1 mM, ce qui confirme les résultats de SAXS et des mesures DOSY. Selon ces résultats, nous avons pu obtenir l'auto-assemblage des objets discrets qui peuvent être considérées comme l'équivalent de macromolécules dendritiques supramoléculaire 10. . Figure 2 Cryo-TEM images pour BTA-Gd (III)-DTPA (à gauche) 1 mM vitrifié à 298 K dans un tampon citrate (100 mM, pH 6), barre d'échelle représente 50 nm;(À droite) 1 mM vitrifié à 298 K dans un tampon citrate (100 mM, pH 6) et une concentration globale de 5 M de NaCl, barre d'échelle représente 50 nm. Jusqu'ici, nous avons seulement travaillé dans des solutions tamponnées de faible force ionique. Toutefois, si électrostatiques forces répulsives de l'périphérique chargée M (III)-DTPA-BTA sur des complexes de Gd (III)-DTPA sont à l'origine de l'frustrée unidimensionnel croissance, on s'attend à ce que augmentant la force ionique de l'environnement tamponnée, utilisant un gaz inerte 01:01 sel avec des contre-ions fortement hydratées, doit réduire les interactions électrostatiques et donc un type différent de l'auto-assemblé objet doit être formée. Dans un tampon citrate comprenant 5 M de NaCl cet effet a été en effet observé (figure 2, à droite). La formation de rapport d'aspect élevé en forme de tige polymères supramoléculaires est clairement observé en cryo-TEM micrographies à force ionique élevée. Dépistage électrostatique est l'explication la plus probable pour cette constatation. Les changements de forme à partir d'un SPHEagrégé riques d'environ 6 nm de diamètre à tiges allongées ayant un diamètre de 6 nm et la longueur de jusqu'à plusieurs centaines de nanomètres. CD mesures de BTA-Gd (III)-DTPA: la mise en marche de coopération auto-assemblage en augmentant la force ionique Le dichroïsme circulaire (CD) spectroscopie mesure la différence d'absorption entre les gauchers et les droitiers lumière polarisée circulairement. Quand un objet hélicoïdale a un sens préféré hélicoïdale, à gauche et à droite la lumière polarisée circulairement sera absorbée à des degrés différents, donnant ainsi naissance à un CD-effet. Étant donné que les liaisons hydrogène intermoléculaires formé entre consécutive BTA-Gd (III)-DTPA dans les agrégats, sont alignés de façon hélicoïdale et le centre stéréogénique à la fraction la L-phénylalanine favorise un sens hélicoïdal sur l'autre, nous nous attendons à un CD clairement spectre de BTA-Gd (III)-DTPA agrégats à base de 11,12. En outre, la spectroscopie CD dépendant de la température est un puissantoutil pour évaluer le mécanisme d'auto-assemblage de BTA-Gd (III)-DTPA polymérisation et permet de tirer des conclusions sur la stabilité des agrégats formés 13. A titre d'exemple, le spectre de CD température ambiante de BTA-Gd (III)-DTPA (8×10 -3 ou mM mM 4×10 -3 dans un tampon à 100 mM de citrate) avec une concentration de sel croissant (0 M de NaCl à 1,0 M de NaCl) sont donnés la figure 3A. Bien qu'une concentration significativement plus faible est appliqué pour les mesures de CD, l'effet Cotton clair indique la présence d'agrégats intacts, même à des concentrations micromolaires. La forme des changements du spectre CD sur augmentant la concentration en sel, qui est une bonne indication pour les interactions réduits à la périphérie des piles et une meilleure emballage des discotics. En outre, les courbes de refroidissement de CD les mêmes solutions (de 363 à 283 K, mesurée à λ = 269 ou 278 nm) montrent des différences dans la forme (figure 3B). L'APT e-mère la température à laquelle commence l'agrégation-décale à des températures supérieures à la concentration en sel plus élevée et un mécanisme de plus coopérative, caractérisé par une augmentation plus abrupte dans le CD-sens, apparaît. Alors que la courbe de refroidissement à 0 M de NaCl est le mieux décrit par une isodesmiques auto-assemblage processus, la courbe de refroidissement à 1,0 M de NaCl est typique pour une coopérative d'auto-assemblage processus 14. Dans le premier cas, toutes les constantes d'association sont supposés être égale alors que dans ce dernier cas d'auto-assemblage se produit dans au moins deux étapes distinctes. Dans la première étape, un «noyau» doit être formé, qui est énergétiquement très défavorable. Après refroidissement en dessous d'une température de polymérisation critique, d'allongement et de croissance exponentielle dans des polymères supramoléculaires de haut poids moléculaire suivante. Quantifier les paramètres thermodynamiques de l'auto-assemblage de BTA-Gd (III)-DTPA à 0 et 1 M de NaCl en utilisant un modèle coopératif révèle clairement la diminution de K <sous> a, qui est l'activation constante adimensionnelle 8. Des valeurs plus faibles pour K un indiquent un degré plus élevé de coopérativité dans le processus d'auto-assemblage, ce qui est exprimé dans la formation de très allongées polymères supramoléculaires observées dans cryo-MET. BTA-Gd (III)-DTPA C NaCl K une 8 x10 -3 mm 0 M 5 10 -2 4 x10 -3 mm M 1 1 10 -4 Tableau 2. Degré de coopérativité exprimé par K a dans l'dépendant de la température d'auto-assemblage de BTA-Gd (III)-DTPA en tant que fonction de la concentration de NaCl (C NaCl). Figure 3. BTA-Gd (III)-DTPA dans un tampon citrate à 100 mM (c = 8 x 10 -3 mm à faible force ionique et 4 x 10 -3 mm à une force ionique élevée) A] de CD spectres enregistrés à 293 K en fonction de la force ionique , c = 0 M de NaCl – 1,0 M, la Δε ellipticité molaire est calculé comme suit: Δε = CD-effet / (cxl) dans laquelle c est la concentration de BTA en mol L -1 et l est la longueur de trajet optique en cm ; B] correspondant courbes de refroidissement CD mesurées à λ = 269 nm pour 0 M de NaCl et 278 nm pour des solutions à 1 M de NaCl exprimé comme le degré d'agrégation Φ n en fonction de la concentration en NaCl c = 0 M de NaCl – 1,0 M, Φ n est calculé en divisant la valeur mesurée de CD-effet par l'effet de CD-maximale.