Контроль размера, формы и стабильность супрамолекулярных полимеров в воде

Схема 1. Самосборка БТА на основе цитрата дискотиков в буфер в сферические агрегаты показывает диаметром около 5 нм, в мМ концентрации блока. Увеличение ионной силы при добавлении NaCl приводит к образованию удлиненных стержней диаметром около 3 нм и длиной> 25 нм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . 1. Подготовка БТА-Б (III) DTPA Решения для CD спектроскопии и измерения в зависимости от температуры CD спектров как функция концентрации NaCl Подготовьте 100 мМ цитратном буфере (рН 6.0). Подготовьте 100 мМ цитратном буфере (рН 6,0) с 2 М NaCl. Растворите 0,254 мг БТА-Б (III) DTPA (MW = 3184 г • моль -1) в 10 мл 100 мМ цитратном буфере, тЦелевые концентрации 8 • 10 -3 мм БТА-Б (III) DTPA. Разрушать ультразвуком решение в течение 5 минут. Заполнить 1 см УФ кювете с раствором и измерить спектр КД от 230 до 350 нм и кривой CD охлаждения на самом высоком группа CD интенсивности (например, λ = 269 нм) от 363 – 283 К со скоростью 1 К мин – 1. Добавьте такой же объем 2 М NaCl буферный раствор цитрата в буферном растворе БТА-Б (III) DTPA в целях увеличения ионной силы до 1 М NaCl, разбавляя дискотиков половине концентрации целевой концентрации 4 • 10 -3 мМ БТА-Б (III) DTPA. Vortex решение с повышенной ионной силой в течение 5 минут. Повторные измерения спектра КД от 230 до 350 нм и кривой CD охлаждения на самом высоком интенсивности полосы CD от 363 – 283 К со скоростью 1 K мин -1. 2. Установка Т-зависимых данных компакт-диска на модель Т-зависимостиЛОР самосборки Исходные данные на CD были экспортированы в происхождении 8.5 и нормализовался. Это было достигнуто путем определения CD эффект на самых высоких измерений температуры, равной 0, а компакт-диск эффект при минимальных измерений температуры, равной 1. Поскольку величина CD-эффект пропорционален степени агрегации 8, нормированные CD-кривых пропорциональны степени агрегации. Нормализованные данные были установлены в рамках нелинейной вариант кривую в OriginPro 8.5 Использование Т-зависимый самостоятельной сборки модели, полученные ван-дер-Schoot 8,9. В этой модели зарождения и удлинение режима отличаются. Первая степень агрегации в режиме растяжения (Т <Т е) была установлена ​​с помощью следующего уравнения: Над уравнении (рядом с переменной температурой, T, и степень aggregation, Φ п) три параметра, т.е. энтальпии удлинение ч е удлинение температуры Т е (температура, при которой самостоятельной сборки начинается), а параметр Φ СБ, который вводится, чтобы Φ п / Φ СБ делает не превышает единицы, что следует из ограничений, что степень агрегации не может превышать единицу. Установка оказывает энтальпии удлинение ч е (Дж / моль) и удлинение температуры Т е (К), которые характеризуют самосборки молекул при данной концентрации. При установке, один ограничения необходимо соблюдать которых является то, что только степень агрегации при температурах ниже Т е должны быть установлены, так как уравнение 2.1 распространяется только на удлинение режима. Далее, экспериментально обнаружены степень агрегациизарождения режим может быть установлен, по следующей формуле: Над уравнении (рядом с переменным Т и Φ п) четыре параметра, которые уже три были определены с уравнением 2.1, т.е. энтальпии удлинение ч е удлинение температуры Т е и параметр Φ SAT. Единственный неизвестный параметр К стоимости описания кооперативности зарождения фазы, которая находится по установке Экспериментально установлено, степень агрегации при температурах выше Т е. 3. Подготовка БТА-Б (III) DTPA решения для электронной микроскопии и визуализации супрамолекулярных полимеров с помощью криогенного TEM Приготовьте два буфера: 100 мМ цитратном буфере (рН 6,0) и 100 мМ цитратном буфере (рН 6,0) Wй 5 М NaCl. Растворите 0,318 мг БТА-Б (III) DTPA (MW = 3184 г • моль -1) в 0,1 мл каждого подготовленного буфера, целевой концентрации 1 мМ БТА-Б (III) DTPA. Пример стеклования для криогенных ТЕМ осуществляется с помощью автоматизированной робот стеклования (FEI Vitrobot Mark III). CryoTEM сетки (R2 / 2 Quantifoil Йена сетки из Quantifoil Micro Tools GmbH) являются поверхности плазмы рассматривается до стеклования процедуры с использованием углерода Cressington 208 для нанесения покрытий, работающих на 5 мА в течение 40 сек. Водный раствор наносится на сетку во время стеклования на автоматизированных FEI Vitrobot. Это связано с применением образца на сетке, блоттинга лишнюю жидкость для создания тонкой пленки из водного раствора на сетку и последующего стеклования путем погружения сетки очень быстро в жидкой этан. После остекловывания образца хранятся в жидком азоте и переносить вручную на автопогрузчик кассеты, а также Cooleг с жидким азотом. Кассета вставляется в автозагрузчик ТЕМ. Все это делается вручную. CryoTEM Эксперименты проводились на ТУ / е cryoTITAN (FEI), ( www.cryotem.nl ). ТУ / е cryoTITAN оборудован полевой эмиссии пистолет (FEG), работающий на 300 кВ. Изображения были записаны с помощью 2к х 2к Gatan CCD камера оснащена сообщение колонке Gatan энергии фильтром (GIF). 4. 1 H-ЯМР DOSY измерений сферических самоорганизующихся БТА-Б (III) DTPA при низкой ионной силы Подготовьте 50 мМ г 6-сукцинат буфера в D 2 O ("рН 6,0), буфер готовят, растворяя г 6-янтарной кислоты в D 2 O, а затем, регулируя рН до 6,0 с помощью 1 М ND 4 OD в D 2 O. Конечной концентрации 50 мМ сукцинат была скорректирована с дополнительными D 2 O. С Gd (III) сильно парамагнитныхи 1 Н сигналов будет тем самым значительно расширить, Gd (III) был заменен на Y (III). Растворить 2,98 мг БТА-Y (III) DTPA (MW = 2979 г • моль -1) в 1 мл 50 мМ г 6-сукцинат буфера в D 2 O ("рН 6,0), цель концентрации 1 мМ БТА- Y (III) DTPA. 1 H-ЯМР DOSY измерения проводятся на Varian Unity Inova 500 Спектрометр оснащен 5 мм ID-PFG зонда от Varian. DOSY эксперименты проводились с использованием DOSY одного выстрела (Doneshot, Varian) импульсной последовательности. 90 градусов, пульс унд перемешивания были адаптированы соответственно. Химические сдвиги ссылаться, используя химический сдвиг 3 – (триметилсилил) пропионовой-2, 2,3,3 – [D 4] натриевая соль (ТСГУ). Самодиффузии HDO был использован для калибровки измерений; известно из литературы, что самодиффузии HDO в D 2 O при 298 К составляет 19,0 × 10-9 м 2 </suр> • с -1. В качестве примера можно самодиффузии HDO в D 2 O была измерена в VARIAN 2 Гц D 2 O стандартных образцов и калибровка к стандартному значению. Модель, используемая для расчета гидродинамических радиусов R Н агрегатов Стокса-Эйнштейна соотношение для распространения сферической частицы. 5. Представитель Результаты 1 H-ЯМР и DOSY МУР измерений на БТА-M (III)-DTPA: сферические объекты в цитратном буфере Ионный характер периферической Gd (III) комплексов представляет разочарование в одномерном росте дискотических мономеров, основной предназначен для полимеризации в удлиненные палочковидные агрегатов. Баланс между притяжения и отталкивания взаимодействия контролирует размер и форму агрегатов (схема 2). Схема 2. Мощная техника, чтобы определить размер и форма частиц в растворе синхротронного источника малый угол рассеяния рентгеновских лучей (МУР). БТА-Б (III)-DTPA растворяли в буферном растворе цитрата и МУР профили были записаны и установлены в области 0,01 <д <0,1 Å -1. Наклон к нулю в области низких д региона (д <0,06 Å -1) указывает на отсутствие анизотропии формы в совокупности, что свидетельствует о наличии сферического объекта (рис. 1). Данных, измеренных в различных концентрациях были установлены помощью однородного монодисперсных сферических форм-фактора приводит к рассчитаны радиуса R, 3,2 нм. Рассчитанные геометрические радиус мономерных дискотических БТА-Б (III)-DTPA составляет 3,0 нм, что свидетельствует о наличии агрегатов с соотношением сторон близким к 1. <br /> Рисунок 1. МУР профили для БТА-Б (III)-DTPA в цитратном буфере (100 мМ, рН 6) в 0,5 и 1,0 мм (сверху). DOSY ЯМР БТА-Y (III)-ДТПА в 50 мМ г 6-сукцинат буфера в 1,0 мм (снизу). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . В целях обеспечения дополнительных доказательств для сферической формы и нанометровых размеров самоорганизующихся объектов, мы провели 1 H диффузии упорядоченная спектроскопия ЯМР (1 H-ЯМР DOSY) (рис. 1). DOSY ЯМР позволяет определить коэффициенты диффузии агрегатов, из которых гидродинамического радиуса (R H) может быть вычислена. С Gd (III) сильно парамагнитных и 1 H сигналов будет тем самым значительно расширить, мы изменили Gd (III) для диамагнитных Y (III). Коэффициентов диффузии агрегированных диамагнитных дискотических амфифила в дейтерированном буфер сукцинат (50 мМ, РН 6, с = 1 мм) была определена в 0.69×10-10 м 2 с -1. Через Стокса-Эйнштейна отношения, мы вычисляем гидродинамического радиуса R H 2,9 нм для дискретных объектов сферической размеров (табл. 1). Эта величина находится в прекрасном согласии с величиной, полученной по данным МУР для БТА-Б (III)-DTPA. БТА-M (III)-DTPA [Мм] D т [10 -10 м 2 с -1] R H [Нм] R б [Нм] 1 0,69 2,9 3,2 от DOSY б от МУР Таблица 1. Результаты МУР и DOSY измерений для БТА-M (III)-DTPA. Cryo-TEM на БТА-Б (III)-DTPA: от сферических объектов удлиненной наностержни Еще одним свидетельством успешного контроля над одномерной стек длина была получена из крио-TEM микрофотографии. В связи с стеклования водных растворов криогенных ТЕМ сохраняет структурную морфологию самоорганизующихся агрегатов и позволяет избежать высыхания влияет, связанных с обычными пробоподготовки ТЕА. 2 (слева) показывает, что БТА-Gd (III)-DTPA производит ожидаемого сферической объектов с диаметром около 6 нм при концентрации 1 мМ, что подтверждает результаты МУР и DOSY измерений. Согласно этим данным, мы смогли получить самоорганизующихся дискретных объектов, которые можно считать эквивалентными супрамолекулярных дендритных макромолекул 10. На рис. 2 Cryo-TEM изображения для БТА-Б (III)-DTPA (слева) и 1 мМ керамический при 298 К в цитратном буфере (100 мМ, рН 6), линейка представляет собой 50 нм;(Справа), 1 мМ керамический при 298 К в цитратном буфере (100 мМ, рН 6) и общее NaCl концентрацией 5 M, линейка составляет 50 нм. До сих пор мы работали только в буферных растворах с низкой ионной силой. Однако, если электростатические силы отталкивания периферической взимается M (III)-DTPA комплексов на БТА-Б (III)-DTPA находятся на происхождение несостоявшегося одномерный рост, мы ожидали, что увеличение ионной силы буферной среды, с использованием инертного 1:01 соли с высокой гидратированных противоионов, следует уменьшить электростатических взаимодействий и, следовательно, различные типы самоорганизующихся объект должен быть сформирован. В цитратного буфера, включающий 5 М NaCl, этот эффект действительно наблюдается (рис. 2, справа). Формирование высокой пропорции палочковидных супрамолекулярных полимеров отчетливо наблюдается в крио-TEM микрофотографии при высокой ионной силой. Электростатическое экранирование является наиболее вероятным объяснением этого вывода. Форма меняется от spherical совокупности около 6 нм в диаметре с удлиненными стержнями диаметром 6 нм и длиной до нескольких сотен нанометров. CD измерения БТА-Б (III)-DTPA: переключение на кооперативных самоорганизации за счет увеличения ионной силы Кругового дихроизма (КД) спектроскопии измеряет разницу в поглощении между левой и правой круговой поляризации света. При спиральной объект предпочтительным винтовой смысле, левой и правой циркулярно поляризованный свет будет поглощаться в разной степени, следовательно, что приводит к CD-эффект. Поскольку межмолекулярные водородные связи образуются между последовательными БТА-Б (III)-DTPA в агрегатах, которые выстроились в винтовой моды и stereogenic центром в L-фенилаланин фрагмент винтовой Позитивные чувства по сравнению с другими, мы ожидаем четкого CD Спектр из БТА-Б (III)-ДТПА на основе агрегатов 11,12. Кроме того, зависит от температуры CD спектроскопия является мощныминструмент для оценки самосборки механизм БТА-Б (III)-DTPA полимеризации и позволяет получить выводы об устойчивости образовавшегося агрегатов 13. Например, компакт-диск комнатной температуре спектры БТА-Б (III)-DTPA (8х10 -3 мм или 4×10 -3 мм в 100 мМ буфера цитрата) при увеличении концентрации соли (0 М NaCl до 1,0 М NaCl) приведены В 3А. Несмотря на значительно более низкой концентрации применяют для CD измерения, эффект хлопка ясно указывает на наличие неповрежденных агрегатов, даже в микромолярных концентрации. Форма изменения спектра КД при увеличении концентрации соли, которая является хорошим показателем для уменьшения взаимодействия на периферии трубы и лучше упаковки дискотиков. Кроме того, CD кривых охлаждения одного и того же решения (363 – 283 К, измеренные при λ = 269 или 278 нм), показывают существенные различия в форме (рис. 3В). APродитель Т электронной температуры, при которой начинается агрегация, переходит на более высокие температуры при более высокой концентрации соли и более механизмом сотрудничества, характеризуются более резкое увеличение CD-эффект, становится очевидной. В то время как кривая охлаждения при температуре 0 М NaCl, лучше всего описывается isodesmic процесса самосборки, кривая охлаждения в 1,0 М NaCl является типичным для совместного процесса самосборки 14. В первом случае все константы ассоциации считаются равными, а в последнем случае самосборка происходит по крайней мере в два этапа. На первом этапе, "ядро" должно быть сформировано что энергетически очень невыгодным. После охлаждения ниже критической температуры полимеризации, удлинение и экспоненциальный рост в супрамолекулярные полимеры с высоким молекулярным весом ниже. Количественная оценка термодинамических параметров самосборки БТА-Б (III)-DTPA в 0 и 1 М NaCl помощью кооперативной модели четко показывает снижение K <SUB>, который является безразмерной постоянной активации 8. Более низкие значения для К указывают на высокую степень кооперативности в процесса самосборки, которая выражается в формировании сильно вытянутых супрамолекулярных полимеров наблюдается в крио-TEM. БТА-Б (III)-DTPA С NaCl К 8 x10 -3 мм 0 M 5 10 -2 4 x10 -3 мм 1 M 1 10 -4 Таблица 2. Степень кооперативности выраженное K в интервале температур зависит от самосборки БТА-Б (III)-DTPA в зависимости от концентрации NaCl (C NaCl). Рисунок 3. БТА-Gг (III)-DTPA в 100 мМ цитратном буфере (с = 8 x10 -3 мм при низкой ионной силы и 4 x10 -3 мм с высокой ионной силой)] CD спектров, снятых при температуре 293 К в зависимости от ионной силы , в NaCl = 0, М – 1,0 М, молярное Δε эллиптичности рассчитывается следующим образом: Δε = CD-эффекта / (CXL), в котором в это концентрация БТА в моль л -1 и л является длина оптического пути в см ; B] CD-корреспондент кривых охлаждения измеряется на λ = 269 нм для 0 М NaCl и 278 нм для 1 М NaCl решения выразил также степень агрегации Φ л в зависимости от концентрации NaCl в NaCl = 0, M – 1,0 M, Φ п рассчитывается путем деления измеренных CD-эффекта максимальной CD-эффект.