El desarrollo de bronquiolitis obliterante en un modelo murino de trasplante de pulmón ortotópico

1. Donante de Procedimiento Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron utilizando una técnica estéril. No se administran antibióticos para el donante y los ratones receptores. La inducción de la anestesia del ratón donante se inicia con isoflurano 5%. El ratón está intubado orotraqueal con un catéter intravenoso de calibre 20 y luego colocado en un respirador de roedores, utilizando oxígeno al 100% a una tasa de 125 respiraciones por minuto y aproximadamente 0,5 ml de volumen corriente (2% de su peso corporal). La anestesia se mantuvo con inhalado 1-2% de isoflurano. El ratón donante se coloca en una posición supina, preparado con 70% de alcohol. Laparosternotomy se realiza como una línea media combinada y la incisión transversal. La heparina a 100 U / kg se inyecta en la vena cava inferior (VCI), desde justo por debajo del hígado. El diafragma se corta a lo largo del enganche ventral costera hacia la columna vertebral, y la cavidad torácica, se expone mediante la reducción de ambos lados del pechopared para el cuello. Después de una incisión en la vena cava inferior a nivel del diafragma, el apéndice auricular derecho está cortado y lavado de los pulmones con 2 ml de refrigeración (4 ° C) de lactato de Ringer inyección y 0,1 ml de heparina a través de una incisión transversal en la raíz de la arteria pulmonar ( PA) del tronco. Detención de ventilación en los dos tercios de final de la espiración la inflación, el bloque corazón-pulmón se extirpa y se almacena en hielo (4 ° C). El pulmón izquierdo del donante se prepara para el destinatario por la unión de los puños. El ligamento pulmonar se realiza una incisión hasta la vena pulmonar (VP). El hilo se lleva a cabo mediante la eliminación de esófago y la aorta. Identificar la AP, que se encuentra en el aspecto más craneal del hilo, así como los bronquios adjuntos principales (Br). Diseccionar cuidadosamente la Autoridad Palestina de los bronquios. Manguito PA está hecha de un calibre 24-intravenosa (IV) del catéter y se corta a 0,5 mm de longitud con una extensión de 0,7 mm. Toda la superficie del manguito es entonces abrasión para facilitar anastomosismosis. El manguito de los bronquios se deriva de un catéter de calibre 20-IV, y cortar en longitud de 1,0 mm con una extensión de 0,7 mm. Utilizando los mismos materiales, el manguito PV varía con el peso del ratón donante. En concreto, para los ratones 24-27 gramos el tamaño del manguito es de calibre 22, 0,7 mm de longitud con una extensión de 0,7 mm. Para ratones pesan 27-32 gramos, los estudios utilizaron un catéter de calibre 20 que es de 0,7 mm de longitud con una extensión de 0,7 mm. Los puños se insertan en los extremos distales de la AP, VP y Br y asegurado con una sutura 9-0. El pulmón donante se vacía y se lavó con solución salina estéril con heparina estéril antes de su almacenamiento. El pulmón donante se envuelve con una gasa estéril empapada en solución salina estéril en hielo (4 ° C), que mantiene el pulmón muy limpio y estéril. Una abrazadera de los microvasos se coloca en el bronquio para evitar la entrada de lactato de Ringer en las vías respiratorias. 2. Receptor Procedimiento La inducción de la anestesiaanestesia y la ventilación mecánica son los mismos como se ha descrito anteriormente para el donante. La pared izquierda del pecho se afeita y prepara con el 70% de alcohol y el campo quirúrgico se cubrió. Una toracotomía se hace en el espacio intercostal izquierdo tercero, extendiendo la incisión dorsalmente cerca de la columna vertebral, y una abrazadera microvasos colocado en los vasos pulmonares izquierdas y bronquios adyacentes al corazón. Usted puede ver PA en el aspecto del cráneo, la energía fotovoltaica en el extremo caudal del hilo y el hermano entre ellos. Utilizando una tracción suave en la pinza hemostática para causar una tensión leve en el PA, el hermano y la fotovoltaica, el pulmón izquierdo se saca de la cavidad torácica, dejando las estructuras hiliares centrales sujeta. El PA, PV y el hermano están aislados mediante disección roma seguido por la colocación de una sutura de 9-0 coloca libremente alrededor de la PA, PV y el hermano. Después de la disección de la Autoridad Palestina por completo de su vaina adventicia, de una pequeña incisión transversal de aproximadamente un cuarto de la circunferencia de la nave eshecha en la pared anterior, dejando la continuación de la parte dorsal de la arteria intacta. El pulmón donante, envuelto en una gasa fría, lactato de Ringer algodón empapada y preparado como se ha descrito anteriormente, se coloca entonces en la cavidad torácica, y puños insertado en el receptor PA, PV y Br y asegurado con 9-0 sutura. El pinzamiento hiliar se elimina lo que permite la reperfusión y la ventilación. Después de colocar el pulmón trasplantado de nuevo en el tórax receptor, la toracotomía se cierra con una sutura de 5-0. El ratón se le permite recuperarse de la anestesia. La buprenorfina (0.05-0.15 mg / kg) se administra inmediatamente después de la cirugía, y por cada 8 horas durante 2-3 días después de la cirugía. 3. Los resultados representativos Nuestra experiencia nos ha enseñado que se requiere de varios meses de práctica repetida para alcanzar la competencia en el modelo murino de trasplante de pulmón. Después de aptitud se logra, que unLOGRADOS una tasa de 96% (96/100 cirugías consecutivas) la supervivencia perioperatoria con las muertes que ocurren dentro de siete días después de la operación. Dos muertes se debieron a hemorragias, que comenzó durante la operación, y pneumothraces fueron la causa de muerte en los otros dos ratones. Para todos los procedimientos, el tiempo de isquemia caliente fue de 14,32 ± 3,14 minutos, y el tiempo de isquemia fría fue de 58,51 ± 18,06 minutos. Tres grupos ortotópico de trasplante de pulmón fueron estudiadas: isoinjerto: C57BL / 6 → C57BL / 6, aloinjerto: C57BL/10 → C57BL / 6 y C57BL / 6 → C57BL/10. Se utilizó sólo los ratones machos pero nuestra técnica puede ser también aplicado a ratones hembra, porque no hay diferencia significativa anatómica entre los sexos. La clasificación de rechazo de la patología se realizó en forma ciega la utilización de criterios uniformes para el trasplante pulmonar clínica 7 (Tabla 1). Mientras que se observó el rechazo leve o no en el isoinjerto (C57BL / 6 → C57BL / 6), las dos combinaciones de aloinjertos desarrolló compañíasel rechazo comparable aguda o crónica (Figura 1). Por el contrario, OB fue significativamente más frecuente en el C57BL/10 → C57BL / 6 que C57BL / 6 → C57BL/10 grupo por day28 (Tabla 1). C57BL / 6 → C57BL / 6 C57BL/10 → C57BL / 6 C57BL / 6 → C57BL/10 P-valor Rechazo de Patología "A" Resultados en el día 28 0,67 ± 0,89 * 3,33 ± 0,82 * 3,29 ± 0,76 * P> 0,05 Ratones ob / totales en 21 y 28 días 0/24 (0%) ** 14/34 (42,1%) ** 2/16 (12,5%) ** P <0,05 Tabla 1. Resultados histológicos de rechazo agudo del trasplante y la prevalencia de la bronquiolitis obliterante mensaje. Puntuación de rechazo agudo ("A" Resultados) por la norma crisisrios como se describe en los resultados representativos. Los datos representan la media ± desviación estándar de "A" Resultados en el trasplante de 28 días después. Los datos representan la cantidad y el porcentaje de ratones en cada grupo que se desarrollaron en el OB 21 y 28 días después del transplante. Figura 1. Los hallazgos macroscópicos y la histopatología en 28 días después de trasplante de pulmón. Grupo 1A representan hallazgos macroscópicos y H & E de pulmón y de pulmón isoinjerto manchada ingenuo derecha. Grupo 1B y 1C representa H & E y tricrómico de Masson manchada BL/10 injerto de pulmón trasplantado en receptor del ratón BL / 6, que se desarrolló OB OB y ​​no, respectivamente. La flecha blanca en 1B identifica las lesiones de OB. Grupo 1D muestra aloinjerto BL / 6 de pulmón trasplantado en receptor del ratón BL/10. Averías principal durante el procedimiento fueron como sigue. Desorden de la sangre de flujo: de pulmón de donantes descarga hastael color se vuelve de color blanco. El uso de una presión excesiva podría inducir edema pulmonar. Sin embargo, no empujar demasiado para evitar el edema después del trasplante. La dificultad de inserción del manguito en el donante: Cerciorarse de que la vasculatura es de una longitud suficiente y libre de grasa y los tejidos adjuntos conectivo. Sangrado en el sitio de la anastomosis: Utilice Q consejos para aplicar presión a la zona afectada durante unos 5 minutos. Receptor de la sangre PA obstrucción del flujo: Principalmente causado por una torsión de la banda durante la inserción. Si el aire se observa dentro de la Autoridad Palestina a continuación, volver a hacer de la anastomosis es necesario. Difícil anastomosis PV: Membrana de la energía fotovoltaica es muy delgada y las lágrimas con facilidad. Seleccione el tamaño del manguito adecuado e insertar directamente al PV del receptor con mucha suavidad. Receptor de la sangre PV obstrucción del flujo: Asegúrese de que la posición y dirección de la banda. Soltar la compresión del manguito bronquial. Neumotórax: Esto puede ser causado por cualquiera de perforación bronquial debido a la manipulation de la vía aérea, o la perforación de la superficie del pulmón debido a un trauma asociado con el procedimiento de trasplante. El primero se trata con el cierre quirúrgico del agujero en la pared las vías respiratorias, y este último es tratado por sobrecosido la fuga en la superficie del pulmón utilizando 10-0 sutura de nylon.