Ontwikkeling van Bronchiolitis obliterans in een muizenmodel van orthotope longtransplantatie

1. Donor Procedure Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd gebruik te maken van steriele techniek. Geen antibiotica worden gegeven aan zowel de donor en de ontvanger muizen. Inductie van anesthesie van de donor muis wordt gestart met 5% isofluraan. De muis is orotracheally geïntubeerd met een 20-gauge intraveneuze katheter en vervolgens geplaatst op een knaagdier ventilator, met behulp van 100% zuurstof met een snelheid van 125 ademhalingen / minuut en ongeveer 0,5 ml ademvolume (2% van zijn lichaamsgewicht). Anesthesie wordt onderhouden met inhalatie 1-2% isofluraan. De donor muis wordt geplaatst in een liggende positie klaargestoomd met 70% alcohol. Laparosternotomy wordt uitgevoerd als een gecombineerde middellijn en transversale incisie. Heparine 100 u / kg wordt geïnjecteerd in het lagere vena cava (IVC) van iets minder dan de lever. Het membraan wordt gesneden langs de ventrale ribbenboog bevestiging in de richting van de wervelkolom, en van de borstholte wordt blootgesteld door het snijden van beide zijden van de borstmuur om de nek. Na insnijden van de IVC op het niveau van het membraan, wordt het rechter atriaal aanhangsel snijden en de longen gespoeld met 2 ml gekoelde (4 ° C) gelacteerde Ringer's injectie en 0,1 ml heparine via een dwarse incisie in de basis van de longslagader ( PA) stam. Arrestatie ventilatie aan twee derde van de end-tidal de inflatie, wordt de hart-long blok uitgesneden en opgeslagen op ijs (4 ° C). De donor linker long is voorbereid voor de ontvanger door de bevestiging van manchetten. De pulmonale ligament wordt ingesneden tot aan de Pulmonary Vein (PV). De navel wordt naar buiten gebracht door het verwijderen van de slokdarm en de aorta. Stel de PA, gelegen aan de schedel aspect van de navel, evenals de bijgevoegde hoofdbronchus (Br). Voorzichtig ontleden de PA van de bronchus. PA manchet is gemaakt van een 24-gauge Intraveneuze (IV) katheter en gesneden tot 0,5 mm met een verlenging van 0,7 mm. Het gehele oppervlak van de manchet wordt geschuurd met anasto vergemakkelijkenMosis. De manchet de bronchus afgeleid van een 20-gauge IV katheter en gesneden in lengte van 1,0 mm met een verlenging van 0,7 mm. Met dezelfde materialen, PV manchet varieert met het gewicht van de donor muis. In het bijzonder voor muizen 24-27 gram van de manchet is 22-gauge, 0,7 mm in de lengte met een 0,7 mm extensie. Voor muizen met een gewicht 27-32 gram, de studies gebruik gemaakt van een 20-gauge katheter die is 0,7 mm in de lengte met een 0,7 mm extensie. De manchetten worden in de distale uiteinden van de PA, PV en Br en vastgezet met een 9-0 hechtdraad. De donor long is gespoeld en gewassen met steriele zoutoplossing met een steriele heparine voor het opbergen. De donor long wordt vervolgens bedekt met een steriel gaasje gedrenkt in een steriele zoutoplossing op ijs (4 ° C), dat houdt de longen zeer schoon en steriel zijn. Een microvaatje klem wordt geplaatst op de bronchus naar Ringerlactaat toegang tot de luchtwegen te voorkomen. 2. Ontvanger Procedure Inductie van Anesthesia en mechanische ventilatie zijn dezelfde als beschreven voor de donor hierboven. De linker borstwand wordt geschoren en klaargestoomd met 70% alcohol en het chirurgische veld wordt gedrapeerd. Een thoracotomie incisie wordt gemaakt in de linker derde intercostale ruimte, uitbreiding van de incisie dorsaal in de buurt van de wervelkolom, en een microvaatje klem op de linker longvaten en bronchus grenzend aan het hart. U kunt PA op de craniale aspect, PV aan het caudale einde van de navel en Br tussen hen. Met behulp van zachte tractie op de hemostaat van lichte spanning op de PA, Br en PV veroorzaken, is de linker long teruggetrokken uit de borstholte, terwijl de centrale hilaire structuren geklemd. De PA, PV en Br worden geïsoleerd door stompe dissectie gevolgd door het plaatsen van een 9-0 hechting los gepositioneerd rond de PA, PV en Br. Na het ontleden van de PA volledig uit de adventitia schede, een kleine dwarse incisie van ongeveer een kwart van de omtrek van het schip isgemaakt in de voorwand, waarbij de voortzetting van de rug van de slagader intact. De donor long, verpakt in koude, Ringerlactaat geweekte gaasje en bereid zoals hierboven beschreven, wordt geplaatst in de borstholte en manchetten ingebracht in de ontvanger PA, PV en Br en vastgezet met 9-0 hechtdraad. De hilair knevel verwijderd waardoor reperfusie en ventilatie. Na het plaatsen van de getransplanteerde long terug in de ontvanger thorax, wordt de thoracotomie incisie gesloten met een 5-0 hechtdraad. De muis is toegestaan ​​om te herstellen van anesthesie. Buprenorfine (0.05 tot 0,15 mg / kg) wordt onmiddellijk toegediend na de operatie, en voor elke 8 uur gedurende 2-3 dagen na de operatie. 3. Representatieve resultaten Onze ervaring heeft ons geleerd dat het vereist een aantal maanden van herhaalde praktijk bekwamen in de muis longtransplantatie model. Na de vaardigheid wordt bereikt, hebben we eenchieved een 96% (96/100 opeenvolgende operaties) peri-operatieve overlevingskans met sterfgevallen die zich binnen zeven dagen na de operatie. Twee doden waren het gevolg van bloeden dat intra begon, en pneumothraces waren de oorzaak van de dood in de andere twee muizen. Voor alle procedures, de warme ischemie tijd was 14.32 ± 3.14 minuten, en koude ischemie tijd was 58.51 ± 18.06 minuten. Drie orthotoop longtransplantatie groepen werden bestudeerd: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, allograft: C57BL/10 → C57BL / 6 en C57BL / 6 → C57BL/10. We alleen gebruikt mannelijke muizen maar onze techniek kan ook worden toegepast voor vrouwelijke muizen, omdat er geen significant verschil anatomische geslachten. Indeling van afwijzing pathologie werd uitgevoerd op een blinde manier gebruik te maken van standaard criteria voor de klinische longtransplantatie 7 (tabel 1). Terwijl we waargenomen milde of geen afwijzing in isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), beide allograft combinaties ontwikkeld bedrijvenlijkbare acute of chronische afstoting (figuur 1). Daarentegen OB werd significant meer in het C57BL/10 → C57BL / 6 dan C57BL / 6 → C57BL/10 groep door day28 (tabel 1). C57BL / 6 → C57BL / 6 C57BL/10 → C57BL / 6 C57BL / 6 → C57BL/10 P-waarde Afwijzing Pathologie "A" Scores op dag 28 0,67 ± 0,89 * 3,33 ± 0,82 * 3,29 ± 0,76 * P> 0,05 OB / Totaal aantal muizen op dag 21 en 28 0/24 (0%) ** 14/34 (42,1%) ** 2/16 (12,5%) ** P <0,05 Tabel 1. Histologische scores van acute afstoting en de prevalentie van bronchiolitis obliterans na de transplantatie. Scoren van acute afstoting ("A" Scores) van Standard CRIteria zoals beschreven in representatieve resultaten. Gegevens de gemiddelde ± SD van "A" scores op dag 28 na transplantatie. Gegevens de hoeveelheid en het percentage van muizen per groep OB ontwikkeld dag 21 en 28 na transplantatie. Figuur 1. Macroscopische bevindingen en histopathologie op 28 dagen na longtransplantatie. Panel 1A vertegenwoordigen macroscopische bevindingen en H & E gekleurd Isograft long en rechts naïef long. Panel 1B en 1C staat voor H & E en trichroom lood Masson BL/10 long allograft getransplanteerd in BL / 6 muis ontvanger, die OB en niet OB ontwikkeld, respectievelijk. De witte pijl in 1B identificeert laesies van OB. Panel 1D toont BL / 6 long allograft getransplanteerd in BL/10 muis ontvanger. Belangrijkste verhelpen van storingen tijdens de procedure als volgt. Doorbloeding stoornis: Flush donor long totwordt de kleur wit van kleur. Het gebruik van overmatige druk zou kunnen leiden tot longoedeem. Maar maak je niet druk te veel om oedeem te voorkomen na transplantatie. Moeilijkheidsgraad van de manchet inbrengen in de donor: Controleer dat hierbij vaatstelsel is van voldoende lengte en vrij van bijgevoegde vet en bindweefsel. Bloeden bij anastomose site: Gebruik Q tips om de druk op de getroffen site geldt voor ongeveer 5 minuten. Ontvanger PA de bloedstroom obstructie: met name veroorzaakt door torsie van de manchet tijdens het inbrengen. Als lucht wordt waargenomen binnen de PA dan opnieuw te doen van de anastomose is noodzakelijk. Moeilijk PV anastomose: Membraan van PV is erg dun is en gemakkelijk tranen. Selecteer de juiste manchet grootte en plaats rechtstreeks naar PV van de ontvanger heel zacht. Ontvanger PV bloedstroom verstopping: Zorg ervoor dat de positie en richting van de manchet. Laat de compressie van de bronchiale cuff. Pneumothorax: Dit kan worden veroorzaakt door bronchiale perforatie door manipulation van de luchtwegen, of perforatie van de longen oppervlak als gevolg van trauma in verband met de transplantatie procedure. De eerste is behandeld met chirurgische afsluiting van de opening in de luchtweg wand en deze wordt behandeld door oversewing het lek van de long oppervlak met 10-0 nylon hechtdraad.