Sviluppo di bronchiolite obliterante in un modello murino di trapianto polmonare ortotopico

1. Procedura di donatori Tutte le procedure chirurgiche sono stati eseguiti utilizzando una tecnica sterile. Non sono indicati gli antibiotici al donatore e topi riceventi. Induzione dell'anestesia del topo donatore è iniziata con il 5% isoflurano. Il topo è orotracheally intubati con un 20-calibro catetere endovenoso e poi posto su un ventilatore roditore, utilizzando ossigeno al 100% ad una velocità di 125 respiri al minuto e circa 0,5 ml di volume di marea (2% del suo peso corporeo). Anestesia per via inalatoria viene mantenuto con isoflurano 1-2%. Il topo donatore viene collocato in posizione supina, preparata con 70% di alcol. Laparosternotomy viene eseguita come una linea mediana combinato e incisione trasversale. Eparina a 100 u / kg è iniettato nella vena cava inferiore (IVC), da sotto il fegato. La membrana viene tagliata lungo la attacco ventrale costale verso la colonna vertebrale, e la cavità toracica è esposto tagliando entrambi i lati del toracemurare al collo. Dopo l'incisione della IVC a livello del diaframma, della appendice atriale destra viene tagliato ed i polmoni lavato con 2 ml di raffreddamento (4 ° C) Ringer lattato di iniezione e 0,1 ml di eparina attraverso una incisione trasversale alla radice dell'arteria polmonare ( PA) tronco. L'arresto di ventilazione a due terzi di fine espirazione l'inflazione, il cuore-polmone blocco viene asportato e conservato su ghiaccio (4 ° C). Il polmone sinistro del donatore viene preparato per il destinatario dal sequestro di bracciali. Il legamento polmonare è inciso fino alla vena polmonare (PV). L'ilo è portato togliendo esofago e aorta. Identificare la PA, situato l'aspetto più craniale del ilo, nonché le bronco allegate principali (Br). Con attenzione sezionare il PA dai bronchi. Bracciale PA è fatto da un 24-gauge endovenosa (IV) catetere e tagliato a 0,5 mm di lunghezza con una estensione di 0,7 mm. L'intera superficie del manicotto viene poi abrasa per facilitare anastomosi. Il manicotto per la bronco è derivato da un calibro del catetere 20-IV, e tagliato in lunghezza di 1,0 mm con una estensione di 0,7 mm. Utilizzando gli stessi materiali, il bracciale PV varia con il peso del topo donatore. In particolare, per i topi 24-27 grammi la dimensione del bracciale è di 22-gauge, 0,7 mm di lunghezza con una estensione 0,7 mm. Per i topi peso 27-32 grammi, gli studi hanno utilizzato un 20-calibro catetere che è di 0,7 mm di lunghezza con una estensione 0,7 mm. I polsini sono inseriti nelle estremità distali delle, PA PV e Br e fissata con una sutura 9-0. Il polmone del donatore viene svuotata e lavata con soluzione salina sterile con eparina sterile prima di riporlo. Il polmone donatore viene quindi avvolto con garza sterile imbevuta in soluzione salina sterile su ghiaccio (4 ° C), che mantiene il polmone molto pulito e sterile. Un morsetto microvasi è posto sulla bronco per impedire l'entrata Ringer lattato nelle vie aeree. 2. Destinatario Procedura Induzione di anesdell'anestesia e ventilazione meccanica sono gli stessi descritti sopra per il donatore. La parete toracica sinistra è rasata e preparata con il 70% di alcol e il campo operatorio è drappeggiato. Una incisione toracotomia è fatto a sinistra terzo spazio intercostale, estendendo l'incisione dorsalmente vicino alla colonna vertebrale, e un morsetto microvasi posto sui vasi polmonari sinistra e dei bronchi adiacenti al cuore. Potete vedere PA all'aspetto cranica, PV alla fine caudale ilo e Fr. tra di loro. Utilizzando una leggera trazione sul pinza emostatica per provocare una leggera tensione sul, PA Br e PV, il polmone sinistro è tirato fuori dalla cavità toracica, lasciando le strutture ilari centrali bloccato. L', PA e PV Br sono isolati per via smussa seguito mettendo una sutura 9-0 posizionato liberamente in tutto il, PA e PV fr. Dopo la dissezione della PA completamente dalla sua guaina avventizia, una piccola incisione trasversale di circa un quarto della circonferenza della nave èfatta nella parete anteriore, lasciando la continuazione della parte dorsale dell'arteria intatto. Il polmone donatore, avvolto in freddo, Ringer lattato-impregnato garza di cotone e preparate come sopra descritto, è quindi posizionato nella cavità toracica, e polsini inserito nel PA ricevente, PV e Br e fissato con 9-0 sutura. Il morsetto a croce ilo viene rimosso consentendo riperfusione e ventilazione. Dopo aver posizionato il polmone trapiantato nuovamente nel torace destinatario, l'incisione toracotomia è chiuso con un 5-0 sutura. Il topo è consentito di recuperare da anestesia. Buprenorfina (0,05-0,15 mg / kg) è somministrato immediatamente dopo l'intervento chirurgico, e per ogni 8 ore per 2-3 giorni post-operatorie. 3. Risultati rappresentativi La nostra esperienza ci ha insegnato che richiede diversi mesi di pratica ripetuta per diventare esperti nel modello di topo trapianto di polmone. Dopo di abilità è raggiunto, abbiamo unchieved un tasso del 96% (96/100 interventi consecutivi) la sopravvivenza perioperatoria con decessi che si verificano entro sette giorni dopo l'intervento. Due morti erano dovute a sanguinamento durante l'intervento che ha avuto inizio, e pneumothraces sono stati la causa di morte negli altri due topi. Per tutte le procedure, il tempo di ischemia calda era 14,32 ± 3,14 minuti, tempo di ischemia fredda era 58,51 ± 18.06 minuti. Tre ortotopici gruppi di trapianto di polmone sono stati studiati: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, trapianto: C57BL/10 → C57BL / 6 e C57BL / 6 → C57BL/10. Abbiamo usato solo i topi maschi, ma la nostra tecnica può essere applicato anche a topi di sesso femminile, perché non vi è alcuna significativa differenza anatomica tra i sessi. La classificazione di rigetto patologia è stata condotta in cieco utilizzando criteri standard per polmone clinica trapianto 7 (Tabella 1). Mentre abbiamo osservato il rigetto lieve o assente in isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), entrambe le combinazioni trapianto allogenico sviluppato aziendeconfrontabili rigetto acuto o cronico (Figura 1). Al contrario, OB era significativamente più frequente nel C57BL/10 → C57BL / 6 di C57BL / 6 → C57BL/10 gruppo di day28 (Tabella 1). C57BL / 6 → C57BL / 6 C57BL/10 → C57BL / 6 C57BL / 6 → C57BL/10 P-value Rifiuto Patologia "A" punteggi a giorno 28 0,67 ± 0,89 * 3,33 ± 0,82 * 3,29 ± 0,76 * P> 0.05 OB / mice totali al giorno 21 e 28 0/24 (0%) ** 14/34 (42,1%) ** 2/16 (12,5%) ** P <0,05 Tabella 1. Punteggi istologiche di rigetto acuto e la prevalenza di trapianto dopo la bronchiolite obliterante. Scoring di rigetto acuto ("a" Scores) dalla norma CRIteri, come descritto nei risultati rappresentativi. I dati rappresenta la media ± SD di "A" punteggi a 28 giorni post-trapianto. I dati rappresenta la quantità e la percentuale di topi in ciascun gruppo che sviluppate OB giorni 21 e 28 trapianto. Figura 1. Reperti macroscopici e istopatologici a 28 giorni dopo il trapianto di polmone. Pannello di 1A rappresentano risultati macroscopici e H & E polmonari Isograft macchiato del polmone destro e ingenuo. Pannello 1B e 1C rappresenta H & E e di Masson tricromica tinto BL/10 trapianto del polmone trapiantato nel ricevente del mouse BL / 6, che ha sviluppato OB OB e non, rispettivamente. La freccia bianca in 1B individua lesioni OB. 1D pannello mostra polmonare BL / 6 trapiantato trapiantato nel ricevente BL/10 mouse. Guasti principale durante la procedura era la seguente. Disturbi del flusso sanguigno: polmone del donatore fino Flushil colore diventa di colore bianco. L'uso di una pressione eccessiva può indurre edema polmonare. Ma non spingere troppo per evitare che l'edema dopo il trapianto. Difficoltà di inserimento nella cuffia del donatore: Accertarsi che la vascolarizzazione è sufficientemente lungo e privo di allegati tessuto adiposo e connettivo. Sanguinamento al sito di anastomosi: Usa suggerimenti Q per esercitare una pressione al sito in questione per circa 5 minuti. Destinatario ostruzione del flusso di sangue PA: principalmente causata dalla torsione del polso durante l'inserimento. Se l'aria si osserva all'interno della PA poi ri-do della anastomosi è necessario. Difficile anastomosi PV: membrana del fotovoltaico è molto sottile e facilmente lacrime. Selezionare corretta dimensione del bracciale ed inserire direttamente PV del destinatario molto delicatamente. Destinatario ostruzione del flusso di sangue PV: Assicurarsi che la posizione e la direzione della cuffia. Rilasciare la compressione dal bracciale bronchiale. Pneumotorace: Ciò può essere causato da una perforazione bronchiale a causa manipulation delle vie aeree, o perforazione della superficie del polmone a causa di trauma associato con la procedura di trapianto. Il primo è trattata con chiusura chirurgica del foro all'interno della parete delle vie aeree, e quest'ultimo è trattata oversewing la perdita sulla superficie polmonare utilizzando 10-0 sutura di nylon.