Колонизация Euprymna scolopes Squid по Vibrio fischeri</em
Summary
Метод описывается процедура, посредством которой Гавайских кальмар бобтейл,<em> Euprymna scolopes</em> И бактериальных симбионтов,<em> Vibrio fischeri</em>, Поднимаются отдельно, а затем ввели, чтобы обеспечить определенный колонизации органа свет кальмаров бактериями. Колонизация обнаружения бактериально-производные люминесценции и прямым подсчетом колонии описаны.
Abstract
Специальные бактерии обнаружены в связи с тканей животных 1-5. Такой хост-бактериальных ассоциаций (симбиоз) может иметь пагубные последствия (патогенные), не фитнес-следствие (комменсалы), либо быть полезным (взаимопомощи). В то время много внимания уделялось патогенные взаимодействия, мало известно о процессах, которые определяют воспроизводимых приобретение полезных / комменсальных бактерии из окружающей среды. Световых орган взаимности между морскими грамотрицательные бактерии V. fischeri и Гавайских бобтейл кальмары, Е. scolopes, представляет собой весьма специфическое взаимодействие, в котором один хозяин (Э. scolopes) устанавливает симбиотические отношения с только одного вида бактерий (В. fischeri) на протяжении всей своей жизни 6,7. Биолюминесценция производства V. fischeri во время этого взаимодействия дает анти-хищный пользу E. scolopes во время ночных мероприятий 8,9, в то времяБогатые питательными веществами тканей хозяина обеспечивает V. fischeri с защитой ниша 10. В каждом хосте поколения, эти отношения воспроизводятся, тем самым обеспечивая предсказуемый процесс, который может быть оценен подробно на различных этапах развития симбиотических. В лаборатории несовершеннолетних кальмар люк aposymbiotically (неколонизированных), и, если они собираются в течение первых 30-60 минут и переданы симбионта без воды не может быть колонизирована за исключением экспериментальных посевной 6. Это взаимодействие обеспечивает, таким образом полезную модель, в которой для оценки отдельных шагов, которые приводят к конкретным приобретение симбиотических микробов из окружающей среды 11,12.
Здесь мы опишем метод оценки степени колонизации, что происходит, когда только что вылупившихся aposymbiotic E. scolopes подвергаются (искусственного) морская вода, содержащая V. fischeri. Этот простой анализ описывает прививки, естественной инфекции и восстановлениебактериальных симбионтов от зарождающегося органа свете E. scolopes. Особое внимание уделяется тому, чтобы обеспечить согласованную среду для животных во время симбиотической развития, особенно в отношении качества воды и света сигналы. Методы характеризуют симбиотических населения описано включают: (1) измерение бактериально-производные биолюминесценции, и (2) прямой подсчет колоний восстановленных симбионтов.
Protocol
Discussion
Колонизация анализа, описанного позволяет для анализа природных симбиотических процессов в контролируемых лабораторных условиях. Как таковой, он может быть использован для оценки колонизации мутантных штаммов, различных природных изолятов и при различных режимах химических вещест?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Маттиаса Gyllborg для поддержки объекта кальмаров и комментариев к этой рукописи, Майкл Хэдфилд и Лаборатории морской Kewalo за помощь в коллекции полей и членов Рубин и Макфолл-Нгай Лаборатория вклад в этот протокол. Работа в лаборатории Мандель поддерживается NSF IOS-0843633.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
