Summary

קולוניזציה של Euprymna scolopes קלמארי על ידי Vibrio fischeri</em

Published: March 01, 2012
doi:

Summary

השיטה מתארת ​​את התהליך שבאמצעותו דיונון הוואי bobtail,<em> Euprymna scolopes</em> ו הסימביונט חיידקי שלה,<em> Vibrio fischeri</em>, גדלים בנפרד ולאחר מכן הציג כדי לאפשר התיישבות מסוים של איבר אור דיונון על ידי החיידקים. איתור קולוניזציה על ידי הארה bacterially הנגזרות ועל ידי ספירת המושבה ישירה מתוארים.

Abstract

חיידקים מסוימים נמצאים בקשר עם רקמה חיה 1-5. אלה מארח חיידקים עמותות (symbioses) יכול להזיק (פתוגניים), ללא השפעה על כושר (commensal), או להיות מועיל (mutualistic). תוך תשומת לב רבה ניתנה אינטראקציות פתוגניים, מעט מאוד ידוע על תהליכי המכתיבים את הרכישה לשחזור של מועילות / commensal חיידקים מהסביבה. הדדיות אור איברים בין חיידק גראם שלילי ימי ו ' fischeri ואת הוואי bobtail דיונון, א scolopes, מייצג אינטראקציה מאוד ספציפיות שבהם אחד מארח (א 'scolopes) היא יוצרת מערכת יחסים סימביוטית עם רק 1 זן חיידקי (פס' fischeri) לאורך כל תקופת חייה 6,7. ביולומינציה המיוצר על ידי ו ' fischeri במהלך האינטראקציה הזו מעניקה יתרון נגד טורפים את א ' scolopes במהלך פעילויות ליליות 8,9, ואילורקמת מזין עשיר המארח מספק V. fischeri עם נישה מוגנים 10. במהלך כל דור המארח, קשר זה הוא סיכם, ובכך מייצג תהליך צפוי כי ניתן להעריך בפירוט בשלבים שונים של פיתוח סימביוטי. במעבדה, דיונון נעורים האץ' aposymbiotically (uncolonized), ואם אסף בתוך 30-60 דקות הראשונות והועברו מים הסימביונט חינם, לא ניתן יישבו אלא הבידוד הניסוי 6. אינטראקציה זו ובכך מספק מערכת מודל שימושי בו כדי להעריך את הצעדים בודדים שהובילו לרכישת מסוים של חיידק סימביוטי מהסביבה 11,12.

כאן אנו מתארים שיטה להעריך את מידת קולוניזציה המתרחשת כאשר שזה עתה בקעו א aposymbiotic scolopes חשופים (מלאכותית) מי ים המכילים V. fischeri. assay זה פשוט מתאר חיסון, דלקת טבעי, והתאוששותהסימביונט של חיידקי מאיבר אור המתהווה של א ' scolopes. טיפול נלקח על מנת לספק סביבה עקבי את בעלי החיים במהלך ההתפתחות סימביוטי, במיוחד בכל הנוגע לאיכות המים רמזים קלים. שיטות לאפיין את האוכלוסייה סימביוטי תיאר כוללים (1) מדידה של ביולומינציה bacterially הנגזרות, ו (2) המושבה ישירה ספירת symbionts התאושש.

Protocol

1. הכנת Inocula בקטריאלי יום 0 יומיים לפני חיסון דיונון, הצלחת זני חיידקים הרלוונטיים על 13 ק"ג אגר. דגירה חיידקים על 25-28 מעלות צלזיוס למשך הלילה. <st…

Discussion

Assay קולוניזציה תיאר מאפשרת ניתוח של תהליך סימביוטי טבעי בסביבת מעבדה מבוקרת. ככזה, הוא יכול לשמש כדי להעריך את ההתיישבות על ידי זנים מוטנטים, לפי מבודד טבעיים שונים, תחת משטרים כימיים שונים. וריאציות על הניסויים המתוארים משמשים בדרך כלל כדי להעריך אספקטים שונים של סי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים מתיאס Gyllborg לתמיכה מתקן דיונון על הערות על כתב היד הזה, מייקל Hadfield ואת מעבדה ימית Kewalo לקבלת סיוע במהלך איסוף בשדה, ואנשי המעבדה רובי McFall-נגאי תרומות לפרוטוקול זה. העבודה במעבדה מנדל נתמך על ידי NSF IOS-0843633.

Materials

Name of reagent Company Catalogue Number Comments
Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter VWR 47729-580  
Caps for Glass Culture Tubes Fisher NC9807998  
Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 Biowave CO8000 Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used.
GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer Promega E5311 Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder.
GloMax 20/20 Light Standard Promega E5341 For luminometer calibration.
Refractometer, Handheld Foster and Smith Aquatics CD-14035 Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up.
Instant Ocean (artificial seawater concentrate) Foster & Smith Aquatics CD-16881 Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter.
Filtration Unit Nalgene 158-0020 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters.
Transfer Pipettes Fisher 13-711-9AM Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings.
Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) Comet T9S (9 oz.) Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9.
Drosophila Vials VWR 89092-720 Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT.
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ISC Bioexpress C-3217-1CS Tubes must fit the shape of the pestles.
Ethanol, 200 Proof Fisher BP2818-100  
Pestles Kimble Chase/Kontes 749521-1500  
Plating Beads, 5 mm diameter Kimble Chase 13500 5 Prepare 5 per tube and autoclave.

References

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
  3. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  4. Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
  5. Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  6. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
  7. Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
  8. McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
  9. Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
  10. Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
  11. Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
  12. Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  13. Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
  14. Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
  15. Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
  16. Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).

Play Video

Cite This Article
Naughton, L. M., Mandel, M. J. Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri. J. Vis. Exp. (61), e3758, doi:10.3791/3758 (2012).

View Video