השיטה מתארת את התהליך שבאמצעותו דיונון הוואי bobtail,<em> Euprymna scolopes</em> ו הסימביונט חיידקי שלה,<em> Vibrio fischeri</em>, גדלים בנפרד ולאחר מכן הציג כדי לאפשר התיישבות מסוים של איבר אור דיונון על ידי החיידקים. איתור קולוניזציה על ידי הארה bacterially הנגזרות ועל ידי ספירת המושבה ישירה מתוארים.
חיידקים מסוימים נמצאים בקשר עם רקמה חיה 1-5. אלה מארח חיידקים עמותות (symbioses) יכול להזיק (פתוגניים), ללא השפעה על כושר (commensal), או להיות מועיל (mutualistic). תוך תשומת לב רבה ניתנה אינטראקציות פתוגניים, מעט מאוד ידוע על תהליכי המכתיבים את הרכישה לשחזור של מועילות / commensal חיידקים מהסביבה. הדדיות אור איברים בין חיידק גראם שלילי ימי ו ' fischeri ואת הוואי bobtail דיונון, א scolopes, מייצג אינטראקציה מאוד ספציפיות שבהם אחד מארח (א 'scolopes) היא יוצרת מערכת יחסים סימביוטית עם רק 1 זן חיידקי (פס' fischeri) לאורך כל תקופת חייה 6,7. ביולומינציה המיוצר על ידי ו ' fischeri במהלך האינטראקציה הזו מעניקה יתרון נגד טורפים את א ' scolopes במהלך פעילויות ליליות 8,9, ואילורקמת מזין עשיר המארח מספק V. fischeri עם נישה מוגנים 10. במהלך כל דור המארח, קשר זה הוא סיכם, ובכך מייצג תהליך צפוי כי ניתן להעריך בפירוט בשלבים שונים של פיתוח סימביוטי. במעבדה, דיונון נעורים האץ' aposymbiotically (uncolonized), ואם אסף בתוך 30-60 דקות הראשונות והועברו מים הסימביונט חינם, לא ניתן יישבו אלא הבידוד הניסוי 6. אינטראקציה זו ובכך מספק מערכת מודל שימושי בו כדי להעריך את הצעדים בודדים שהובילו לרכישת מסוים של חיידק סימביוטי מהסביבה 11,12.
כאן אנו מתארים שיטה להעריך את מידת קולוניזציה המתרחשת כאשר שזה עתה בקעו א aposymbiotic scolopes חשופים (מלאכותית) מי ים המכילים V. fischeri. assay זה פשוט מתאר חיסון, דלקת טבעי, והתאוששותהסימביונט של חיידקי מאיבר אור המתהווה של א ' scolopes. טיפול נלקח על מנת לספק סביבה עקבי את בעלי החיים במהלך ההתפתחות סימביוטי, במיוחד בכל הנוגע לאיכות המים רמזים קלים. שיטות לאפיין את האוכלוסייה סימביוטי תיאר כוללים (1) מדידה של ביולומינציה bacterially הנגזרות, ו (2) המושבה ישירה ספירת symbionts התאושש.
Assay קולוניזציה תיאר מאפשרת ניתוח של תהליך סימביוטי טבעי בסביבת מעבדה מבוקרת. ככזה, הוא יכול לשמש כדי להעריך את ההתיישבות על ידי זנים מוטנטים, לפי מבודד טבעיים שונים, תחת משטרים כימיים שונים. וריאציות על הניסויים המתוארים משמשים בדרך כלל כדי להעריך אספקטים שונים של סי?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים מתיאס Gyllborg לתמיכה מתקן דיונון על הערות על כתב היד הזה, מייקל Hadfield ואת מעבדה ימית Kewalo לקבלת סיוע במהלך איסוף בשדה, ואנשי המעבדה רובי McFall-נגאי תרומות לפרוטוקול זה. העבודה במעבדה מנדל נתמך על ידי NSF IOS-0843633.
Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |