استعمار Euprymna scolopes الحبار بواسطة الضمة fischeri</em
Summary
الأسلوب يحدد الاجراءات التي من الحبار قصير الذيل هاواي،<em> Euprymna scolopes</em> ولها المتكافل البكتيرية،<em> الضمة fischeri</em>، تربى على حدة ومن ثم قدم للسماح للاستعمار محدد من جانب الجهاز ضوء الحبار بواسطة البكتيريا. وصفت من قبل الكشف عن الاستعمار التلألؤ جرثوميا المشتقة والعد مستعمرة مباشرة.
Abstract
تم العثور على بكتيريا محددة بالتعاون مع الأنسجة الحيوانية 1-5. هذه المضيفة للبكتيريا الجمعيات (symbioses) يمكن أن يكون ضارا (الممرضة)، ليس لديهم نتيجة للياقة البدنية (commensal)، أو أن تكون مفيدة (المنفعة المتبادلة). بينما تم إيلاء اهتمام كبير للتفاعلات المسببة للأمراض، ولا يعرف سوى القليل عن العمليات التي تملي اكتساب استنساخه من المفيد / commensal البكتيريا من البيئة. وتبادل المنافع والمصالح للضوء الجهاز بين هذه البكتيريا سالبة الجرام البحرية V. fischeri وهاواي قصير الذيل الحبار، E. scolopes، يمثل التفاعل محددة للغاية في أي واحد مضيف (E. scolopes) يؤسس علاقة تكافلية مع واحد فقط الأنواع البكتيرية (ف. fischeri) طوال فترة من عمر البطارية 6،7. تلألؤ بيولوجي التي تنتجها V. fischeri خلال هذا التفاعل يعطي فائدة لمكافحة المفترسة إلى E. scolopes خلال الأنشطة الليلية 8،9، في حينالنسيج المضيف الغنية بالمغذيات ويوفر V. fischeri مع مكانة المحمية 10. خلال كل جيل المضيفة، وخصت هذه العلاقة، ويمثل بالتالي عملية يمكن التنبؤ بها والتي يمكن تقييمها بالتفصيل في مراحل مختلفة من التنمية التكافلية. في المختبر، والحبار الأحداث يفقس aposymbiotically (uncolonized)، وإذا تم جمعها في غضون الدقائق ال 30-60 الأولى، ونقل إلى المتكافل خالية من المياه، لا يمكن إلا من قبل المستعمر اللقاح التجريبي 6. هذا التفاعل يوفر بالتالي نظام نموذجا مفيدا في أي لتقييم الخطوات الفردية التي تؤدي إلى اكتساب المحددة لميكروب التكافلية من البيئة 11،12.
نحن هنا وصفا لطريقة لتقييم درجة من الاستعمار الذي يحدث عندما فقست حديثا E. aposymbiotic ويتعرض scolopes إلى (الاصطناعي) التي تحتوي على مياه البحر V. fischeri. هذا الفحص بسيط يصف التلقيح، العدوى الطبيعية، والانتعاشمن المتكافل البكتيرية من الجهاز ضوء الوليدة من E. يؤخذ scolopes. العناية لتوفير بيئة متناسقة لهذه الحيوانات خلال تطوير التكافلية، وخاصة فيما يتعلق بنوعية المياه والعظة ضوء. أساليب لتحديد خصائص السكان التكافلية صفها وتشمل (1) قياس التألق الحيوي جرثوميا المشتقة، و (2) مستعمرة مباشرة عد من المتكافلة استردادها.
Protocol
Discussion
الفحص الاستعمار صفها يسمح لتحليل عملية تكافلية الطبيعية في بيئة مختبر للرقابة. على هذا النحو، يمكن استخدامه لتقييم من قبل الاستعمار سلالات متحولة، من عزلة طبيعية مختلفة، وتحت مختلف النظم الكيماوية. ويشيع استخدام الاختلافات في التجارب المذكورة لتقييم مختلف جوانب ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفان بالشكر ماتياس Gyllborg للحصول على دعم مرفق الحبار وللتعليقات على هذه المخطوطة، مايكل هادفيلد ومختبر البحرية Kewalo للحصول على المساعدة خلال الجمع الميداني، وأعضاء في مختبر روبي ومكفال نجاي، لما قدمته من مساهمات في هذا البروتوكول. ويدعم العمل في مختبر ماندل بواسطة جبهة الخلاص الوطني 0843633-IOS.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
