Summary

استعمار Euprymna scolopes الحبار بواسطة الضمة fischeri</em

Published: March 01, 2012
doi:

Summary

الأسلوب يحدد الاجراءات التي من الحبار قصير الذيل هاواي،<em> Euprymna scolopes</em> ولها المتكافل البكتيرية،<em> الضمة fischeri</em>، تربى على حدة ومن ثم قدم للسماح للاستعمار محدد من جانب الجهاز ضوء الحبار بواسطة البكتيريا. وصفت من قبل الكشف عن الاستعمار التلألؤ جرثوميا المشتقة والعد مستعمرة مباشرة.

Abstract

تم العثور على بكتيريا محددة بالتعاون مع الأنسجة الحيوانية 1-5. هذه المضيفة للبكتيريا الجمعيات (symbioses) يمكن أن يكون ضارا (الممرضة)، ليس لديهم نتيجة للياقة البدنية (commensal)، أو أن تكون مفيدة (المنفعة المتبادلة). بينما تم إيلاء اهتمام كبير للتفاعلات المسببة للأمراض، ولا يعرف سوى القليل عن العمليات التي تملي اكتساب استنساخه من المفيد / commensal البكتيريا من البيئة. وتبادل المنافع والمصالح للضوء الجهاز بين هذه البكتيريا سالبة الجرام البحرية V. fischeri وهاواي قصير الذيل الحبار، E. scolopes، يمثل التفاعل محددة للغاية في أي واحد مضيف (E. scolopes) يؤسس علاقة تكافلية مع واحد فقط الأنواع البكتيرية (ف. fischeri) طوال فترة من عمر البطارية 6،7. تلألؤ بيولوجي التي تنتجها V. fischeri خلال هذا التفاعل يعطي فائدة لمكافحة المفترسة إلى E. scolopes خلال الأنشطة الليلية 8،9، في حينالنسيج المضيف الغنية بالمغذيات ويوفر V. fischeri مع مكانة المحمية 10. خلال كل جيل المضيفة، وخصت هذه العلاقة، ويمثل بالتالي عملية يمكن التنبؤ بها والتي يمكن تقييمها بالتفصيل في مراحل مختلفة من التنمية التكافلية. في المختبر، والحبار الأحداث يفقس aposymbiotically (uncolonized)، وإذا تم جمعها في غضون الدقائق ال 30-60 الأولى، ونقل إلى المتكافل خالية من المياه، لا يمكن إلا من قبل المستعمر اللقاح التجريبي 6. هذا التفاعل يوفر بالتالي نظام نموذجا مفيدا في أي لتقييم الخطوات الفردية التي تؤدي إلى اكتساب المحددة لميكروب التكافلية من البيئة 11،12.

نحن هنا وصفا لطريقة لتقييم درجة من الاستعمار الذي يحدث عندما فقست حديثا E. aposymbiotic ويتعرض scolopes إلى (الاصطناعي) التي تحتوي على مياه البحر V. fischeri. هذا الفحص بسيط يصف التلقيح، العدوى الطبيعية، والانتعاشمن المتكافل البكتيرية من الجهاز ضوء الوليدة من E. يؤخذ scolopes. العناية لتوفير بيئة متناسقة لهذه الحيوانات خلال تطوير التكافلية، وخاصة فيما يتعلق بنوعية المياه والعظة ضوء. أساليب لتحديد خصائص السكان التكافلية صفها وتشمل (1) قياس التألق الحيوي جرثوميا المشتقة، و (2) مستعمرة مباشرة عد من المتكافلة استردادها.

Protocol

1. إعداد قائح البكتيرية اليوم 0 قبل يومين من التلقيح الحبار، لوحة سلالات بكتيرية ذات الصلة على LBS 13 أجار. احتضان البكتيريا في 25-28 درجة مئوية خلال الليل. <li style=";text-align:right;dire…

Discussion

الفحص الاستعمار صفها يسمح لتحليل عملية تكافلية الطبيعية في بيئة مختبر للرقابة. على هذا النحو، يمكن استخدامه لتقييم من قبل الاستعمار سلالات متحولة، من عزلة طبيعية مختلفة، وتحت مختلف النظم الكيماوية. ويشيع استخدام الاختلافات في التجارب المذكورة لتقييم مختلف جوانب ا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفان بالشكر ماتياس Gyllborg للحصول على دعم مرفق الحبار وللتعليقات على هذه المخطوطة، مايكل هادفيلد ومختبر البحرية Kewalo للحصول على المساعدة خلال الجمع الميداني، وأعضاء في مختبر روبي ومكفال نجاي، لما قدمته من مساهمات في هذا البروتوكول. ويدعم العمل في مختبر ماندل بواسطة جبهة الخلاص الوطني 0843633-IOS.

Materials

Name of reagent Company Catalogue Number Comments
Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter VWR 47729-580  
Caps for Glass Culture Tubes Fisher NC9807998  
Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 Biowave CO8000 Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used.
GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer Promega E5311 Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder.
GloMax 20/20 Light Standard Promega E5341 For luminometer calibration.
Refractometer, Handheld Foster and Smith Aquatics CD-14035 Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up.
Instant Ocean (artificial seawater concentrate) Foster & Smith Aquatics CD-16881 Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter.
Filtration Unit Nalgene 158-0020 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters.
Transfer Pipettes Fisher 13-711-9AM Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings.
Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) Comet T9S (9 oz.) Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9.
Drosophila Vials VWR 89092-720 Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT.
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ISC Bioexpress C-3217-1CS Tubes must fit the shape of the pestles.
Ethanol, 200 Proof Fisher BP2818-100  
Pestles Kimble Chase/Kontes 749521-1500  
Plating Beads, 5 mm diameter Kimble Chase 13500 5 Prepare 5 per tube and autoclave.

References

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
  3. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  4. Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
  5. Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  6. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
  7. Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
  8. McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
  9. Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
  10. Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
  11. Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
  12. Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  13. Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
  14. Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
  15. Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
  16. Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).

Play Video

Cite This Article
Naughton, L. M., Mandel, M. J. Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri. J. Vis. Exp. (61), e3758, doi:10.3791/3758 (2012).

View Video