Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri</em
Summary
Yöntemine göre Hawaiian Bobteylleri squid prosedür özetlenmektedir<em> Euprymna scolopes</em> Ve bakteriyel symbiont,<em> Vibrio fischeri</em>, Bakteriler tarafından kalamar ışık organın belirli kolonizasyon için izin tanıtıldı ayrı ayrı, sonra yükseliyor. Bakteriyel kaynaklı lüminesans ve doğrudan koloni sayımı ile kolonizasyon tespit açıklanmıştır.
Abstract
Spesifik bakteri hayvan dokusu 1-5 ile birlikte bulunur. Böyle ana-bakteriyel dernekler (symbioses) (patojen) zararlı olabilir, hiçbir spor sonucu (ortakçı), ya da (mutualist) faydalı olabilir. Çok dikkat patojen etkileşimleri verilmiş olsa da, biraz ortamdan ortakçı / yararlı bakterilerin tekrarlanabilir satın dikte süreçleri hakkında bilinmektedir. Deniz Gram-negatif bakteri arasında ışık organı karşılıkçılık V. fischeri ve Hawai Bobteyli kalamar, E. scolopes, bir ana (E. scolopes) ömrü 6,7 boyunca yalnızca bir bakteri türü (V. fischeri) ile simbiyotik bir ilişki kurar ki bir çok spesifik bir etkileşim gösterir. V. tarafından üretilen Biyolüminesens Bu etkileşim sırasında fischeri E. bir anti-yırtıcı yarar sağlar nokturnal faaliyetleri sırasında scolopes 8,9 ikenbesin açısından zengin konak doku sağlar V. Korumalı bir niş 10 fischeri. Her ana üretimi sırasında, bu ilişki dolayısıyla simbiyotik gelişiminin çeşitli aşamalarında ayrıntılı bir biçimde tespit edilebilir, öngörülebilir bir süreci temsil değinmeyecek edilir. İlk 30-60 dakika içinde toplanan ve symbiont-serbest su transfer edilirse laboratuarda, yavru kalamar ambar aposymbiotically (uncolonized), ve, deneysel inokulum 6 dışında kolonize olamaz. Bu etkileşim, böylece çevreye 11,12 bir simbiyotik mikrop spesifik kazanım yol tek tek adımların değerlendirmek için yararlı olan bir model sistemi sağlar.
Burada yeni aposymbiotic E. yumurtadan oluşur kolonizasyon derecesini değerlendirmek için bir yöntem tarif scolopes (yapay) deniz suyu içeren maruz V. fischeri. Bu basit test aşılama, doğal enfeksiyon ve kurtarma açıklarE. doğmakta olan ışık organ bakteriyel symbiont arasında scolopes. Bakım özellikle su kalitesi ve ışık işaretleri ile ilgili, simbiyotik gelişim sırasında hayvanlar için tutarlı bir ortam sağlamak için alınır. Açıklanan simbiyotik nüfus karakterize etmek Yöntemleri bakteriyel kaynaklı biyolüminesensin (1) ölçümü ve geri symbionts sayımı (2) doğrudan koloni bulunmaktadır.
Protocol
Discussion
Tarif kolonizasyonu tahlil, bir laboratuvar ortamında, doğal bir proses simbiyotik analizi için olanak sağlar. Bunun gibi, farklı doğal izole tarafından mutant soylar, ve farklı kimyasal rejimlerinde kolonizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir. Açıklanan varyasyonlar ile ilgili deneyler yaygın sembiyoz farklı yönleriyle değerlendirmek için kullanılmıştır. Kolonizasyonu kinetikleri tesadüf detektörü çıkartılmış olduğu bir sintilasyon sayacı otomatik olarak tespit edilebilir ilk 24 saa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kalamar tesisleri destek için ve bu elyazması hakkında yorum Michael Hadfield ve saha toplama sırasında yardım için Kewalo Deniz Laboratuarı, bu protokol için katkıları Ruby ve McFall-Ngai Laboratuvar üyeleri için Gyllborg Mattias teşekkür ederim. Mandel Laboratuvarında Çalışma NSF IOS-0843633 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
