Summary

La colonizzazione delle Euprymna scolopes Squid da Vibrio fischeri</em

Published: March 01, 2012
doi:

Summary

Il metodo descrive la procedura con cui il calamaro hawaiano bobtail,<em> Euprymna scolopes</em> E il suo simbionte batterica,<em> Vibrio fischeri</em>, Vengono allevati separatamente e poi introdotta per consentire colonizzazione specifica dell'organo luce calamari dai batteri. Rilevamento colonizzazione da parte di luminescenza batteri derivati ​​e conteggio delle colonie diretta sono descritti.

Abstract

Batteri specifici sono presenti in associazione con tessuti animali 1-5. Tali host-batteriche associazioni (simbiosi), può essere dannoso (patogeno), non hanno alcuna conseguenza fitness (commensale), o essere di beneficio (mutualità). Mentre molta attenzione è stata data alle interazioni patogeni, si sa poco sui processi che determinano l'acquisizione riproducibile di benefici / commensale batteri dall'ambiente. La luce-organo mutualismo tra la marina batterio Gram-negativo V. fischeri e la Hawaiian Bobtail calamari, E. scolopes, rappresenta una interazione altamente specifica in cui un host (E. scolopes) stabilisce un rapporto simbiotico con una sola specie batteriche (V. fischeri) nel corso della sua vita 6,7. Bioluminescenza prodotta da V. fischeri durante questa interazione fornisce un anti-predatorio beneficio E. scolopes durante le attività notturne 8,9, mentreil tessuto ricco di nutrienti host fornisce V. fischeri con una nicchia protetta 10. Durante ogni generazione host, questo rapporto si riassume, rappresentando così un processo prevedibile che può essere valutata in dettaglio vari stadi di sviluppo simbiotico. In laboratorio, del minore calamari sportello aposymbiotically (colonizzati), e, se raccolti entro i primi 30-60 minuti e trasferito al simbionte priva di acqua, non possono essere colonizzati se non lo sperimentale inoculo 6. Questa interazione fornisce pertanto un sistema utile modello in cui per valutare i singoli passaggi che portano alla acquisizione specifico di un microbo simbiotico dall'ambiente 11,12.

Qui si descrive un metodo per valutare il grado di colonizzazione che si verifica quando appena schiusi aposymbiotic E. scolopes sono esposti a (artificiale) contenenti acqua di mare V. fischeri. Questo saggio descrive semplice inoculazione, l'infezione naturale, e il recuperodel simbionte batterico dall'organo luce nascente E. scolopes. cura è presa per fornire un ambiente coerente per gli animali durante lo sviluppo simbiotico, con particolare riguardo alla qualità dell'acqua e segnali luminosi. Metodi per caratterizzare la popolazione simbiotica descritta includono (1) misura della bioluminescenza batteri-derivati, e (2) colonia diretta conteggio di simbionti recuperati.

Protocol

1. Preparazione di inoculi batterica Giorno 0 Due giorni prima calamari inoculazione, la piastra dei ceppi batterici rilevanti su LBS 13 agar. Incubare batteri a 25-28 ° C durante la notte. Giorno 1 Inoculare 3 LBS ml di media cultura in un tubo di vetro con una colonia di ogni V. ceppo fischeri per l'infezione. Preparare duplicare i tubi come backup. Giorno 2 (Coordi…

Discussion

Il dosaggio colonizzazione descritto permette l'analisi di un processo naturale simbiotico in un ambiente di laboratorio controllato. Come tale, può essere utilizzato per valutare colonizzazione da ceppi mutanti mediante diversi isolati naturali, e sotto regimi chimici differenti. Variazioni su gli esperimenti descritti sono comunemente usati per valutare diversi aspetti della simbiosi. La cinetica di colonizzazione può essere misurata esaminando luminescenza durante le prime 24 ore, che può essere rilevata autom…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano per il supporto Mattias Gyllborg impianto di calamari e dei commenti a questo manoscritto, Michael Hadfield e il Laboratorio Kewalo Marine per l'assistenza durante la raccolta campo, ei membri del Laboratorio di Ruby e McFall-Ngai per i contributi a questo protocollo. Il lavoro nel laboratorio di Mandel è supportato da NSF IOS-0843633.

Materials

Name of reagent Company Catalogue Number Comments
Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter VWR 47729-580  
Caps for Glass Culture Tubes Fisher NC9807998  
Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 Biowave CO8000 Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used.
GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer Promega E5311 Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder.
GloMax 20/20 Light Standard Promega E5341 For luminometer calibration.
Refractometer, Handheld Foster and Smith Aquatics CD-14035 Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up.
Instant Ocean (artificial seawater concentrate) Foster & Smith Aquatics CD-16881 Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter.
Filtration Unit Nalgene 158-0020 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters.
Transfer Pipettes Fisher 13-711-9AM Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings.
Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) Comet T9S (9 oz.) Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9.
Drosophila Vials VWR 89092-720 Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT.
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ISC Bioexpress C-3217-1CS Tubes must fit the shape of the pestles.
Ethanol, 200 Proof Fisher BP2818-100  
Pestles Kimble Chase/Kontes 749521-1500  
Plating Beads, 5 mm diameter Kimble Chase 13500 5 Prepare 5 per tube and autoclave.

References

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Cite This Article
Naughton, L. M., Mandel, M. J. Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri. J. Vis. Exp. (61), e3758, doi:10.3791/3758 (2012).

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