Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria
Summary
Noi descriviamo un metodo per generare le cellule T normativo, di memoria e naif da un singolo donatore di sangue umano. Polarizzato Tregs può essere quindi confrontato con altri sottoinsiemi in una varietà di applicazioni genetiche e funzionali con omogeneità genetica, comprendente un saggio di soppressione anche dettagliati qui.
Abstract
Lo sviluppo e la manutenzione di immunosoppressori CD4 + cellule T regolatorie (Tregs) contribuiscono alla tolleranza periferica necessario per rimanere in omeostasi immunologica con la grande quantità di antigeni self e commensali nel e sul corpo umano. Perturbazioni in bilico tra Tregs e infiammatorie cellule T convenzionali può portare a immunopatologia o il cancro. Sebbene iniezione terapeutico di Tregs ha dimostrato di essere efficace in modelli murini di colite 1, diabete di tipo I 2, artrite reumatoide e malattia dell'innesto verso l'ospite, 4 varie differenze fondamentali umano contro topo Treg biologia 5 ha finora precluso l'uso clinico. La mancanza di numero sufficiente, la purezza, la stabilità e la specificità di homing terapeutica Tregs necessaria una piattaforma dinamica di sviluppo umano su cui Treg per ottimizzare le condizioni per la loro espansione ex vivo 6.
Qui D TuttoEscribe un metodo per la differenziazione di indotto Tregs (iTregs) da un singolo donatore di sangue periferico umano che può essere suddiviso in quattro fasi: isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, selezione magnetico di cellule T CD4 +, in coltura cellulare in vitro e fluorescenza attivato di separazione delle cellule (FACS) di sottoinsiemi di cellule T. Poiché la firma fattore di trascrizione Treg P3 forkhead scatola (FoxP3) è una attivazione indotta da fattore di trascrizione nell'uomo 7 e nessun altro marcatore unico esiste, un pannello combinatoria di marcatori devono essere utilizzati per identificare cellule T con attività soppressiva. Dopo sei giorni di coltura, le cellule del nostro sistema può essere delimitato in ingenui cellule T, cellule T di memoria o iTregs in base alla loro relativa espressione di CD25 e CD45RA. Mentre le cellule T di memoria e ingenuo hanno diversi requisiti di polarizzazione segnalati e plasticities 8, pre-selezione della popolazione iniziale delle cellule T in CD45RA + e + CD45RO sottoinsiemi possono be utilizzato per esaminare queste discrepanze. Coerentemente con gli altri, il nostro CD25 Hi CD45RA – iTregs esprimono alti livelli di FoxP3 9, GITR e CTLA-4 11 e bassi livelli di CD127 12. Dopo FACS di ciascuna popolazione, le cellule risultanti possono essere utilizzati in un saggio soppressore che valuta la relativa capacità di ritardare la proliferazione di carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE)-marcato cellule T autologhe.
Protocol
Discussion
Mentre il trasferimento Treg detiene un enorme promessa terapeutica nella lotta contro il rigetto del trapianto autoimmunità e altri disturbi del sistema immunitario o infiammatorio-mediata, i metodi per la loro generazione efficiente e stabile di mantenimento non sono ancora state sviluppate. Poiché solo il 1-5% delle cellule T circolanti sono Tregs, la loro espansione e la differenziazione controllata supera questa carenza come un deterrente importante di attuazione del Tregs nella clinica. D'altra parte, come a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
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