ونحن تصف طريقة لتوليد خلايا تي التنظيمية، والذاكرة وساذجة من متبرع الدم البشري واحد. ويمكن مقارنة Tregs الاستقطاب ثم إلى مجموعات فرعية أخرى في مجموعة متنوعة من التطبيقات الوراثية والوظيفية مع تجانس الجينية، بما في ذلك فحص قمع بالتفصيل هنا أيضا.
تطوير وصيانة CD4 + التنظيمية مناعة الخلايا التائية (Tregs) المساهمة في تحمل الطرفية اللازمة للبقاء في التوازن المناعية مع الكم الهائل من مستضدات الذات وcommensal في وعلى الجسم البشري. يمكن أن الاضطرابات في التوازن بين Tregs والتهابات الخلايا التائية التقليدية يؤدي في الباثولوجيا المناعية أو السرطان. على الرغم من أن ثبت الحقن العلاجية للTregs أن تكون فعالة في الفئران نماذج من التهاب القولون 1، النوع الأول من مرض السكري 2، والتهاب المفاصل الروماتيزمي والكسب غير المشروع مقابل المضيف المرض، و 4 عدة فروق جوهرية في مجال البيولوجيا Treg الإنسان مقابل 5 الماوس وبذلك حالت دون حتى استخدام السريري. استلزم عدم توافر العدد الكافي، والنقاء، والاستقرار، وخصوصية صاروخ موجه من Tregs العلاجية منصة حيوية للتنمية البشرية على Treg التي لتحسين الظروف لتوسعها المجراة سابقا 6.
مد هنا نحنescribe وسيلة للتمايز Tregs التي يسببها (iTregs) من نفس واحدة الإنسان المانحة الدموية المحيطية والتي يمكن تقسيمها إلى أربع مراحل: عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى، واختيار المغناطيسي للخلايا CD4 + T، في خلية ثقافة المختبر، ومضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) من مجموعات فرعية الخلايا التائية. منذ توقيع نسخ Treg عامل forkhead P3 مربع (FoxP3) هو عامل النسخ التنشيط التي يسببها البشر (7) ويجب عدم استخدام أي علامة أخرى فريدة من نوعها موجودا، لجنة توافقية من علامات لتحديد الخلايا التائية مع النشاط المكثف. بعد ستة أيام في الثقافة، لا يمكن ترسيم الخلايا في نظامنا إلى الخلايا التائية السذاجة، وخلايا تي الذاكرة أو iTregs على أساس التعبير النسبية من CD25 و CD45RA. كما الخلايا التائية الذاكرة والسذاجة لديها متطلبات مختلفة عن الاستقطاب وplasticities 8، قبل فرز السكان تي الخلية الأولية إلى + CD45RA وCD45RO + يمكن فرعية باستخدام البريد لدراسة هذه التناقضات. بما يتفق مع الآخرين، لدينا CD25 مرحبا CD45RA – iTregs مستويات عالية من التعبير عن FoxP3 9، GITR وCTLA 4-11 وانخفاض مستويات CD127 12. بعد FACS من كل السكان، ويمكن استخدام الخلايا الناتجة في فحص القامع الذي يقيم القدرة النسبية لتأخير انتشار carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) المسمى ذاتي الخلايا التائية.
في حين نقل Treg يحمل وعدا العلاجية الهائلة في مجال مكافحة الكسب غير المشروع الرفض المناعة الذاتية وغيرها من الاضطرابات المناعية أو التهابات بوساطة، وأساليب لجيلهم كفاءة وصيانة مستقر حتى الآن لم يتم تطويرها. كما 1-5٪ فقط من تعميم خلايا تي هي Tregs، توسعها للرقابة والمفاضل?…
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
AIM-V | Gibco | 0870112 | |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |