Summary

جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

ونحن تصف طريقة لتوليد خلايا تي التنظيمية، والذاكرة وساذجة من متبرع الدم البشري واحد. ويمكن مقارنة Tregs الاستقطاب ثم إلى مجموعات فرعية أخرى في مجموعة متنوعة من التطبيقات الوراثية والوظيفية مع تجانس الجينية، بما في ذلك فحص قمع بالتفصيل هنا أيضا.

Abstract

تطوير وصيانة CD4 + التنظيمية مناعة الخلايا التائية (Tregs) المساهمة في تحمل الطرفية اللازمة للبقاء في التوازن المناعية مع الكم الهائل من مستضدات الذات وcommensal في وعلى الجسم البشري. يمكن أن الاضطرابات في التوازن بين Tregs والتهابات الخلايا التائية التقليدية يؤدي في الباثولوجيا المناعية أو السرطان. على الرغم من أن ثبت الحقن العلاجية للTregs أن تكون فعالة في الفئران نماذج من التهاب القولون النوع الأول من مرض السكري والتهاب المفاصل الروماتيزمي والكسب غير المشروع مقابل المضيف المرض، و 4 عدة فروق جوهرية في مجال البيولوجيا Treg الإنسان مقابل 5 الماوس وبذلك حالت دون حتى استخدام السريري. استلزم عدم توافر العدد الكافي، والنقاء، والاستقرار، وخصوصية صاروخ موجه من Tregs العلاجية منصة حيوية للتنمية البشرية على Treg التي لتحسين الظروف لتوسعها المجراة سابقا 6.

مد هنا نحنescribe وسيلة للتمايز Tregs التي يسببها (iTregs) من نفس واحدة الإنسان المانحة الدموية المحيطية والتي يمكن تقسيمها إلى أربع مراحل: عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى، واختيار المغناطيسي للخلايا CD4 +في خلية ثقافة المختبر، ومضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) من مجموعات فرعية الخلايا التائية. منذ توقيع نسخ Treg عامل forkhead P3 مربع (FoxP3) هو عامل النسخ التنشيط التي يسببها البشر (7) ويجب عدم استخدام أي علامة أخرى فريدة من نوعها موجودا، لجنة توافقية من علامات لتحديد الخلايا التائية مع النشاط المكثف. بعد ستة أيام في الثقافة، لا يمكن ترسيم الخلايا في نظامنا إلى الخلايا التائية السذاجة، وخلايا تي الذاكرة أو iTregs على أساس التعبير النسبية من CD25 و CD45RA. كما الخلايا التائية الذاكرة والسذاجة لديها متطلبات مختلفة عن الاستقطاب وplasticities قبل فرز السكان تي الخلية الأولية إلى + CD45RA وCD45RO + يمكن فرعية باستخدام البريد لدراسة هذه التناقضات. بما يتفق مع الآخرين، لدينا CD25 مرحبا CD45RA iTregs مستويات عالية من التعبير عن FoxP3 GITR وCTLA 4-11 وانخفاض مستويات CD127 12. بعد FACS من كل السكان، ويمكن استخدام الخلايا الناتجة في فحص القامع الذي يقيم القدرة النسبية لتأخير انتشار carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) المسمى ذاتي الخلايا التائية.

Protocol

1. عزلة الإنسان الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من معطف بافي الحصول على وحدة واحدة من معطف بوفي من المستشفى أو في مكان قريب موقع مركز الدم. مركزنا الدم يوفر لنا حول 40-60 مل من معطف بوفي لكل وحدة تم الحصول عليها …

Discussion

في حين نقل Treg يحمل وعدا العلاجية الهائلة في مجال مكافحة الكسب غير المشروع الرفض المناعة الذاتية وغيرها من الاضطرابات المناعية أو التهابات بوساطة، وأساليب لجيلهم كفاءة وصيانة مستقر حتى الآن لم يتم تطويرها. كما 1-5٪ فقط من تعميم خلايا تي هي Tregs، توسعها للرقابة والمفاضل?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> والكتاب أود أن أشكر جنيفر غريبة وبومان جريج على المساعدة التي قدموها مع تحليل التدفق الخلوي والفرز. وأيد هذا العمل من قبل عدد المنح المعاهد الوطنية للصحة 2P20 RR020171 من NCRR وجامعة للأموال بدء التشغيل كنتاكي إلى وزير الخارجية؛ GIE يقر بدعم من زمالة دراسات عليا الرئاسي والزمالة الفرصة كنتاكي.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R  
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110  
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052  
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157  
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155  
The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Falcon 352008  
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-368  
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Falcon 352059  
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-364  
Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Falcon 353047  
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Grenier Bio-One 650180  
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer Gibco 72400  
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000  
β-Mercaptoethanol Sigma M7522  
Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62  
Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63  
Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals Inc. 810531  
0.5 M EDTA Amresco E177  
Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
DNase II MP Biomedicals Inc. 190370  
MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter    
FlowJo Software Tree Star, Inc.    
Cell Quest Pro Software BD Biosciences    
Newborn Calf Serum Gibco 16010  
L-glutamine Gibco 25030  
AIM-V Gibco 0870112  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554  
Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140  
40 μM Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340  

References

  1. Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
  2. Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
  3. Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
  4. Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
  5. Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
  6. Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
  7. Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
  8. Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
  9. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
  10. McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
  11. Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
  12. Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
  13. Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
  14. Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).

Play Video

Cite This Article
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

View Video