Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi
Summary
Biz organotipik serebellar dilim kültürlerde yetişen bireyin Purkinje hücre dendritik ağacın morfolojisi görüntülemek ve kantitatif tayini için izin veren bir protokol mevcut. Bu protokol, Purkinje dendritik hücre gelişme mekanizmaları üzerinde çalışmalar teşvik etmek için tasarlanmıştır.
Abstract
Onlar sagital düzlemde kesinlikle odaklı ve küçük kemirgenler 3 Postnatal dönemde çoğunlukla geliştiren etkileyici bir dendritik ağaç var çünkü Purkinje hücreleri, dendritik gelişim eğitimi için cazip bir model sistem vardır. Dahası, çeşitli antikorların anti-Calbindin D28K ile tüm işlemleri dahil olmak üzere, seçici olarak ve yoğun bir etiket Purkinje hücreleri, en yaygın olarak kullanılan hangi kullanılabilir. Canlı hücrelerde dendritlerin görüntülemek için, Purkinje hücreleri 11 seçici EGFP ifade farelerde Jackson laboratuarlar aracılığıyla mevcuttur. Purkinje hücre dendritik ağacın dendritik genişleme çoğu aslında kültür periyodu 4 sırasında yer alıyor, çünkü Organotipik serebellar dilim kültürlerin hücreleri Purkinje hücre dendritik gelişim kolay deneysel manipülasyon sağlar. Biz burada organotypi yetiştirilen Purkinje hücre dendritik morfoloji görüntüleme ve analiz için kısa, güvenilir ve kolay protokolü sunarızc serebellar dilim kültürleri. Birçok amaç için, Purkinje dendritik hücre ağaç hakkında nicel bir değerlendirme arzu edilir. Biz hızla ve kolayca anti-kalbindin lekeli serebellar dilim kültürleri tespit edilebilir iki parametre, dendritik ağaç büyüklüğü ve şube nokta numaraları, burada odak. Bu iki parametre Purkinje hücre dendritik ağacın değişikliklerin güvenilir ve hassas bir ölçü verir. Protein Kinaz C (PKC) aktivatör PMA ve dendritik gelişme farklılıklar görüntülenmiştir ve nicel değerlendirildi olduklarını göstermek metabotropik glutamat reseptör 1 (mGluR1) ile tedavi örnek kullanılması. Geniş bir dendritik ağaç, seçici ve yoğun immun yöntemler, dendritik mekanizmaları ifşa ettiği için Purkinje hücreleri güçlü bir model sistem haline Purkinje hücre spesifik EGFP ifadesi ile dendritik büyüme ve bir fare modeli dönemini kapsayacak organotipik dilim kültürlerin varlığının kombinasyonu gelişme.
Protocol
Discussion
Yöntemler organotipik serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücre dendritik gelişimini incelemeye yarayan ve nicelik dendritik ağaç büyüklüğü ve dendritik dallanma noktaları sayısını ölçerek Purkinje hücre dendritik genişleme değerlendirmek izin Burada sunulan. Tabii ki, Purkinje hücre dendritler daha kapsamlı ve sofistike bir kantitatif analiz, toplam dendritik uzunluğunu belirlerken bir Sholl analizlere ya da dendritik ağacın fraktal boyut belirleyerek, örneğin mümkündür. Bu tür bir ana…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biomedikal Bölümü, ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A-116624) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
References
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
- Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
- Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).
- Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
- Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
- Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
- Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
- Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).
