L'analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique
Summary
Nous présentons un protocole qui permet de visualiser et d'évaluer quantitativement la morphologie de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje individuelles cultivées en culture organotypique de tranche de cervelet. Ce protocole a pour but de promouvoir les études sur les mécanismes de développement de Purkinje cellules dendritiques.
Abstract
Cellules de Purkinje sont un système modèle intéressant pour l'étude du développement dendritique, parce qu'ils ont un arbre dendritique impressionnante qui est strictement orienté dans le plan sagittal et se développe surtout dans la période post-natale chez les petits rongeurs 3. En outre, plusieurs anticorps qui sont disponibles marquer les cellules de Purkinje sélective et intensive, y compris tous les processus, avec des anti-calbindine D28K étant le plus largement utilisé. Pour l'affichage de dendrites dans les cellules vivantes, des souris exprimant l'EGFP de manière sélective dans les cellules de Purkinje 11 sont disponibles auprès des laboratoires Jackson. Organotypiques cérébelleuse cultures tranche cellules permettent facilement manipulation expérimentale du développement de Purkinje cellules dendritiques parce que la plupart de l'expansion de l'arbre dendritique Purkinje cellules dendritiques qui se passe réellement pendant la période de culture 4. Nous présentons ici un bref protocole fiable et facile pour la visualisation et l'analyse de la morphologie dendritique des cellules de Purkinje cultivé dans organotypic cultures tranche de cervelet. Pour de nombreuses raisons, une évaluation quantitative de l'arbre de Purkinje cellules dendritiques est souhaitable. Nous nous concentrons ici sur deux paramètres, la taille des arbres dendritiques et les numéros de point de branchement, qui peuvent être rapidement et facilement déterminées à partir anti-calbindine tachées cultures tranche de cervelet. Ces deux paramètres donnent une mesure fiable et sensible des variations de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje. En utilisant l'exemple des traitements avec la protéine kinase C PMA (PKC) et l'activateur de récepteurs métabotropiques du glutamate 1 (mGluR1), nous montrons comment les différences dans le développement dendritique sont visualisés et évalués quantitativement. La combinaison de la présence d'un arbre dendritique étendues, les méthodes sélectives et immunomarquage intense, aux cultures organotypiques de tranches qui couvrent la période de croissance dendritique et d'un modèle de souris avec des cellules de Purkinje EGFP expression spécifique des cellules de Purkinje faire un modèle de système puissant pour révéler les mécanismes de dendritique développement.
Protocol
Discussion
Les méthodes présentées ici permettent d'étudier le développement de cellules dendritiques Purkinje en culture organotypique de tranche de cervelet et d'évaluer quantitativement l'expansion Purkinje cellules dendritiques en mesurant la dimension des arbres dendritique et le nombre de points de ramification dendritique. Bien sûr, une analyse plus approfondie et quantitatif sophistiqué des dendrites des cellules de Purkinje est possible, par exemple en déterminant la longueur totale dendritique, effec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Université de Bâle, Département de la biomédecine, et le Fonds national suisse (31003A-116 624).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
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