على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط
Summary
نقدم البروتوكول الذي يسمح لعرض وتقويم كمي والتشكل من شجرة شجيري الخلايا العصبية الفردية التي تزرع في عضوي النمط الثقافات شريحة المخيخ. ويهدف هذا البروتوكول إلى تعزيز الدراسات حول آليات الخلية العصبية تنمية شجيري.
Abstract
الخلايا العصبية هي نظام نموذج جذاب لدراسة التنمية شجيري، لأن لديهم شجرة شجيري إعجاب وهو موجه بدقة في المستوى السهمي وتطوير معظمها في فترة ما بعد الولادة في القوارض الصغيرة 3. وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة تتوفر العديد من التي يجري الخلايا تسمية انتقائي وبشكل مكثف العصبية بما في ذلك جميع العمليات، مع المضادة للCalbindin D28K الأكثر استخداما على نطاق واسع. لمشاهدة من التشعبات في الخلايا الحية والفئران معربا عن EGFP انتقائي في الخلايا العصبية 11 هي المتاحة من خلال مختبرات جاكسون. عضوي النمط المخيخ شريحة الثقافات خلايا تسمح التلاعب التجريبية سهلة من الخلايا العصبية تنمية شجيري لأن معظم التوسع شجيري من شجيري العصبية شجرة الخلية تدور بالفعل خلال الفترة ثقافة 4. نقدم هنا باختصار، بروتوكول موثوقة وسهلة لعرض وتحليل مورفولوجيا شجيري الخلايا العصبية المزروعة في organotypiج الثقافات شريحة المخيخ. لأغراض كثيرة، والتقييم الكمي للشجيري العصبية شجرة الخلية أمر مرغوب فيه. ونحن نركز هنا على معلمتين، شجيري حجم الشجرة وأرقام النقطة فرع، والتي يمكن بسرعة وبسهولة تحديد من الألغام المضادة للcalbindin الملون الثقافات شريحة المخيخ. هذه المعلمتين تسفر عن مقياس موثوق وحساسة للتغيرات في شجرة الخلية الجذعية العصبية. باستخدام المثال من العلاجات مع بروتين كيناز C PMA المنشط (بي كي سي) ومستقبلات الغلوتامات metabotropic 1 (mGluR1) ونحن لشرح كيفية الاختلافات في التنمية شجيري هي تصور وتقييم كمي. مزيج من وجود شجرة شجيري واسعة، وأساليب المناعية انتقائية ومكثفة والثقافات شريحة عضوي النمط التي تغطي فترة من النمو شجيري ونموذج الفأر مع التعبير العصبية الخلية EGFP محددة تجعل الخلايا العصبية نظام نموذجي قوية لإبراز آليات شجيري التنمية.
Protocol
Discussion
عرض الأساليب هنا تسمح لدراسة العصبية تنمية شجيري خلية في عضوي النمط الثقافات شريحة المخيخ وتقييم كمي العصبية التوسع شجيري الخلايا عن طريق قياس شجيري حجم الشجرة وكانت عدد من النقاط فرع شجيري. بطبيعة الحال، على تحليل أكثر شمولا وتطورا كميا من التشعبات الخلية العصبية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جامعة بازل، قسم الطب الحيوي، واللجنة الوطنية السويسرية مؤسسة العلوم (31003A-116624).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
References
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
- Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
- Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).
- Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
- Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
- Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
- Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
- Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).
