הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג' בתרבויות Slice Organotypic
Summary
אנו מציגים פרוטוקול המאפשר להציג וכמותית לתחת המורפולוגיה של העץ הדנדריטי של תאים בודדים פורקינג' גדלו בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic. פרוטוקול זה נועד לקדם מחקרים על המנגנונים של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג'.
Abstract
תאי פורקינג' הם מערכת מודל אטרקטיבית ללימוד פיתוח הדנדריטים, כי יש להם עץ הדנדריטי מרשים שהוא בהחלט בכיוון במטוס sagittal ומתפתח בעיקר בתקופה שלאחר הלידה במכרסמים קטנים 3. יתר על כן, כמה נוגדנים זמינים אשר באופן סלקטיבי ואינטנסיביים תאי תווית פורקינג' כולל את כל התהליכים, עם D28K אנטי Calbindin להיות בשימוש הנרחב ביותר. לצפייה של הדנדריטים בתאי חיים, עכברים מבטאים EGFP סלקטיבי בתאי פורקינג' 11 זמינים דרך מעבדות ג'קסון. תאי תרבויות פרוסות cerebellar Organotypic לאפשר מניפולציה ניסויית קלה של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג' כי רוב התרחבות הדנדריטים של העץ הדנדריטי תא פורקינג' אכן מתרחש בתקופת התרבות 4. אנו מציגים פרוטוקול קצר, אמין וקל לצפייה וניתוח המורפולוגיה של תאי דנדריטים פורקינג' גדלה בorganotypi כאןג תרבויות פרוסות מוח הקטנים. למטרות רבות, הערכה כמותית של העץ הדנדריטי תא פורקינג' רצויה. נתמקד להלן בשני פרמטרים, גודל עץ הדנדריטי ומספרי נקודות של סניף, שניתן לקבוע במהירות ובקלות מהתרבויות פרוסות אנטי calbindin המוכתמות cerebellar. שני פרמטרים אלו מניבים מדד אמין ורגיש של שינויים של העץ הדנדריטי תא פורקינג'. באמצעות הדוגמא של טיפולים עם החלבון קינאז C (PKC) activator PMA וקולט metabotropic גלוטמט 1 (mGluR1) אנחנו מדגימים כיצד הבדלים בהתפתחות הדנדריטים הם דמיינו וכמותית הוערכה. שילוב של הנוכחות של עץ הדנדריטים נרחב, שיטות immunostaining סלקטיבית ואינטנסיביות, תרבויות פרוסות organotypic שמכסות תקופה של צמיחת הדנדריטים ומודל עכבר עם ביטוי EGFP פורקינג' תא מסוים להפוך תאי פורקינג' מערכת מודל רבת עצמה עבור לחשוף את המנגנונים של הדנדריטים פיתוח.
Protocol
Discussion
השיטות שהוצגו כאן מאפשרים ללמוד פיתוח הדנדריטים תא פורקינג' בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic וכדי להעריך כמותית הרחבת הדנדריטים תא פורקינג' על ידי מדידת גודל עץ הדנדריטי ומספר נקודתי הסתעפות הדנדריטים. כמובן, ניתוח כמוני מקיף ומתוחכם יותר של דנדריטים הסלולריים פור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האוניברסיטה של באזל, המחלקה לביו, והשויצרית הקרן הלאומית למדע (31003A-116624).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
References
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
- Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
- Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).
- Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
- Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
- Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
- Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
- Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).
