De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen
Summary
We beschrijven een protocol dat toelaat om en kwantitatief beoordelen van de morfologie van de dendritische structuur van afzonderlijke Purkinje cellen gekweekt in organotypische cerebellum slice culturen. Dit protocol is bedoeld om studies te bevorderen over de mechanismen van Purkinje cel dendritische ontwikkeling.
Abstract
Purkinje-cellen zijn een aantrekkelijk modelsysteem voor het bestuderen van dendritische ontwikkeling, omdat ze een indrukwekkende dendritische boom die strikt gericht is in het sagittale vlak en ontwikkelt vooral in de postnatale periode bij kleine knaagdieren, 3. Bovendien zijn verschillende antilichamen beschikbaar die selectief en intensief label Purkinje cellen inclusief alle processen met anti-Calbindin D28K wordt de meest algemeen gebruikt. Voor het bekijken van dendrieten in levende cellen, muizen die EGFP selectief in Purkinje cellen 11 zijn verkrijgbaar via Jackson labs. Organotypische cerebellaire slice culturen cellen maken een eenvoudige experimentele manipulatie van Purkinje cell dendritische ontwikkeling, omdat de meeste van de dendritische uitbreiding van de Purkinje cel dendritische boom is eigenlijk die plaatsvinden tijdens de kweekperiode 4. We presenteren hier een korte, betrouwbare en gemakkelijke protocol voor het bekijken en analyseren van de dendritische morfologie van Purkinje cellen gekweekt in organotypic cerebellaire slice culturen. Voor vele doeleinden, een kwantitatieve evaluatie van de Purkinje cel dendritische structuur gewenst. Wij richten ons hier op twee parameters, dendritische boom grootte en tak point getallen, die kan snel en eenvoudig worden bepaald op basis van anti-calbindin lood cerebellaire slice culturen. Deze twee parameters leveren een betrouwbare en gevoelige maat voor veranderingen van de Purkinje cel dendritische boom. Het voorbeeld van behandelingen met de proteïne kinase C (PKC) activator PMA en de metabotrope glutamaat receptor 1 (mGluR1) we zien hoe verschillen in dendritische ontwikkeling gevisualiseerd en kwantitatief beoordeeld. De combinatie van de aanwezigheid van een uitgebreide dendritische boom selectieve en intense immunokleuring methoden organotypische slice culturen die de periode van dendritische groei en een muismodel bedekken met Purkinje celspecifieke EGFP expressie maken Purkinjecellen een krachtig modelsysteem voor het onthullen van de mechanismen van dendritische ontwikkeling.
Protocol
Discussion
De methoden die hier staat te stellen Purkinje cel dendritische ontwikkeling te bestuderen in organotypische cerebellum slice culturen en Purkinje cel dendritische groei kwantitatief te evalueren door het meten van dendritische boom grootte en het aantal van dendritische tak punten. Natuurlijk een uitgebreide en verfijnde kwantitatieve analyse van Purkinje cell dendrieten mogelijk, bijv. door bepaling van totale dendritische lengte uitvoeren van een analyse Sholl of bepalen van de fractale afmeting van de dendritische b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Basel, Ministerie van biogeneeskunde, en de Zwitserse National Science Foundation (31003A-116624).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
References
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
- Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
- Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).
- Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
- Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
- Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
- Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
- Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).
